Cytell 细胞成像技术用于中药注射液安全性评价的优势和意义材料方法.PDF

应用笔记 Cytell全自动细胞成像分析仪 Cytell 细胞成像技术用于中药注射液安全性评价的优势和意义 陈登云，郑精智，张津（GEHC-LS ） 李炎，王叔桥，陈婕（四川省食品药品检验研究所） 中药注射剂具有高效、安全、低毒的特点，是发展中医药、解决中医急症用药的方向， 已愈来愈受到人们的重视。许多中药注射剂被列为《全国中医医院急诊科室必备中成药》， 如鱼腥草、生脉、参麦、清开灵、参附、灯盏花、血塞通注射液等。 穿琥宁注射剂主要成分为穿心莲内酯琥珀酸半酯单钾盐，主要用于病毒性肺炎、病毒性 上呼吸道感染的治疗[1] [2] 。其不良反应多由细胞毒性引起 。本研究以穿琥宁注射剂为例研究 中药注射剂的安全性检测技术。 当食品与药品检测机构以及医疗面对数以千计的抽样检查时，直接用小鼠检测方法就显 得不合时宜，得到的 LD50 结果也仅仅是半定量结果，检测成本较高，仅仅适合于初步的科 学研究以及中药注射液临床前安全性检测需求。随着 3R 原则的不断深入人心以及法规的不 断完善，细胞替代实验技术成为必然的选择[3] 。 MTT 检测法是行业内检测细胞毒性的经典技术，但方法本身容易出现误差大，对操作 细节要求较高。Cytell 全自动细胞成像分析仪是必威体育精装版出现的细胞毒性分析技术，它将数字显 微镜、图像式细胞分析仪和细胞计数器的功能集合为一体。本研究将进一步比较 MTT 法与 Cytell 技术在检测穿琥宁注射液安全性检测上的差异，为中药注射液安全性检测方法提供新 的思路。 材料 试验药物 穿琥宁注射液均为市售药品，A 为粉针剂，B 为水针剂。 使用的产品 Cytell 全自动细胞成像分析仪 货号：29-0567-49 Cytell 细胞活力测试试剂盒 货号：29-0574-96 方法 方法 1 ：传统MTT 细胞活力检测法 方法 2 ：全新Cytell 细胞成像分析技术 步骤 1 ：L929 小鼠成纤维细胞以每孔 1000 个细胞接种于 96 孔培养板，37°C ，48h 步骤 2 ：根据穿琥宁有效成分浓度用细胞培养液倍数稀释为0 至 5 mg/mL 的 7 个浓度梯度，将 L929 细胞换入加了药物的培养液，37°C ，48h ，每个浓度条件6 组重复 步骤 3 ：PBS 中配置 5 mg/mL MTT 新鲜溶液。 每 步骤 3 ：将活力测定试剂盒配置成2X 母液，每孔 孔加入 20μL MTT 溶液，37°C ，3-4h 加入 100 μL 母液，37°C ，45min 步骤 4 ：在 Cytell 全自动细胞成像分析仪上选择细 步骤 4 ：倒去培养液，用PBS 清洗 1-2 次 胞活力模块分析 步骤 5 ：用 150μL DMSO 重悬 MTT 代谢产物甲瓒， 彻底混匀使其溶解，45min 应用笔记 Cytell全自动细胞成像分析仪 步骤 6 ：用分光光度计在 570 nm 读数并减去 630 nm 背景。 Excel 中记录读值用于进一步分析。 测定结果 传统 MTT 检测方法不灵敏、结果误差大 图 1、MTT 分析法检测两种穿琥宁注射液细胞毒性比较 从图 1 MTT 分析法检测两种穿琥宁注射液细胞毒性比较可以看出，粉针剂和水针剂看 不出明显的细胞毒性差异，在不同浓度水平上的细胞增殖率抑制测定结果都在各自的误差波 动范围内（如表 1 所示，细胞增值率测定的标准偏差均在 5% 以上），从统计学意义上，粉 针剂的细胞毒性有小于水针剂的趋势，但不明显。尤其是当药物浓度达到 5.0mg/mL 时，细 胞增殖率出现明显不合理的上升，应该属于一些未知原因的实验方法误差。这