DNA的序列分析是进一步研究和改造目的基因的基础。-中国试剂网.PDF

中国试剂网 3.13.7.5 DNA 测序技术 在分子生物学研究中，DNA 的序列分析是进一步研究和改造目的基因的基础。 目前用于测序的技术主要有 Sanger 等（1977）发明的双脱氧链末端终止法和 Maxam 和 Gilbert （1977）发明的化学降解法。这二种方法在原理上差异很大， 但都是根据核苷酸在某一固定的点开始，随机在某一个特定的碱基处终止，产生 A ，T，C，G 四组不同长度的一系列核苷酸，然后在尿素变性的PAGE 胶上电泳 进行检测，从而获得DNA 序列。目前 Sanger 测序法得到了广泛的应用。 Sanger 法测序的原理就是利用一种 DNA 聚合酶来延伸结合在待定序列模 板上的引物。直到掺入一种链终止核苷酸为止。每一次序列测定由一套四个单独 的反应构成，每个反应含有所有四种脱氧核苷酸三磷酸(dNTP)，并混入限量的一 种不同的双脱氧核苷三磷酸(ddNTP) 。由于ddNTP 缺乏延伸所需要的 3-OH 基团， 使延长的寡聚核苷酸选择性地在 G、A 、T 或 C 处终止。终止点由反应中相应的 双脱氧而定。每一种dNTPs 和 ddNTPs 的相对浓度可以调整，使反应得到一组长 几百至几千碱基的链终止产物。它们具有共同的起始点，但终止在不同的的核苷 酸上，可通过高分辨率变性凝胶电泳分离大小不同的片段，凝胶处理后可用 X 光胶片放射自显影或非同位素标记进行检测。 第一节 非同位素银染测序系统操作技术 一、概述： Promega 公司的 SILVER SEQUENCETM DNA 测序系统是一种无放射性的 序列分析系统，它通过灵敏的银染方法检测凝胶中的条带。 银染提供了一种对 于放射性或荧光法来说更加快速，廉价的替代方法。测序结果可以在同一天内得 到；电泳完成后经 90 分钟就可读序，这是常规的放射性测序法做不到的。 此外, SILVER SEQUENCETM 系统用未修饰的 5OH 寡聚核苷酸作为引物， 减少了特 殊修饰寡聚核苷酸的花费。该系统不需要放射性方法中对同位素的谨慎操作，也 不需要荧光法或化学发光技术的昂贵试剂。另外，也不需要象大多数荧光法那样 用仪器来检测序列条带。 Taq DNA 聚合酶在 95℃时极强的热稳定性。本系统利用的测序级Taq DNA 聚合酶是一种Taq DNA 聚合酶的修饰产品，对于双链DNA 模板有非常好的效果， 具有高度的准确性，能产生均一的条带，且背景低。 中国试剂网 3.13.7.5 SILVER SEQUENCETM 系统包含被修饰的核苷酸混合物 ，如 7 去氮 dGTP(7-deaza dGTP，或 dITP)替代 dGTP 可清除由 GC 丰富区域所引起的条带压 缩现象。 退火温度是热循环测序中最重要的因素。高退火温度可减少模板二级结构。 提高引物结合模板配对的严谨性。链重退火和模板二级结构则限制了小片断PCR 产物(500bp)得到清楚的序列数据的能力。引物延伸起始于每个循环的退火阶 段。在较低温度时，聚合酶可能会遇到坚固的二级结构区域，它可导致聚合酶解 离。则在四个电泳道中均有同一相对位置的条带。因为这些原因，应该使用尽可 能高的退火温度。对于有牢固二级结构的模板建议使用 95℃变性、70℃退火/延 伸的循环模式。一般来说，较长的引物及 GC 含量高的引物能得到较强的信号。 实验结果表明，24mer 的GC 含量约为 50%的引物可得到最佳结果。 由于本系统采用热循环装置, 与常规的测序方法相比具有如下几点好处：(1). 本方法线性扩增模板 DNA