Experiment 11 滤膜过滤法.DOC

Experiment 11 濾膜過濾法 前言 大腸桿菌（學名：Escherichia coli，通常簡寫爲E. coli）)是人和動物腸道中最主要和數量最多的一種細菌，主要寄生於大腸內。是一種兩端鈍圓、能運動、無芽孢的革蘭氏陰性短桿菌。除某些菌型能引起腹瀉外，一般不致病，能合成維生素B和K，對人體有益。 目的 學習以濾膜法檢驗的大腸菌類數量，由實驗中利用M-Endo agar培養基或M-Endo培養培養大腸菌類以及以大腸菌類所形成之綠色金屬光澤菌落進行計數。 原理 與冗長的多管發酵法實驗過程相較，以濾膜法測定大腸菌類顯得簡單許多。主要原理是將水樣經由抽氣幫浦真空抽氣，使其通過孔徑0.45±0.02um、直徑為47㎜之無菌濾膜，大腸菌類因無法濾過而留置於濾膜上。接著將已過濾的濾膜置於吸滿乳糖培養液或Lauryl tryptose 培養液之飽和吸收墊上，在攝氏35±0.5℃恆溫下培養1.5～2小時，接著出濾膜移置M-Endo agar培養基或M-Endo培養液之飽和吸收墊上，攝氏35±0.5℃恆溫下培養22～24小時。培養過程中，大腸菌類會分解乳糖，產生氣體和醛類，醛類會與培養基(液)中的鹼性洋紅染料結合，在光線反射之下，呈現綠色金屬光澤的菌落，據此計算大腸菌類的數目。 通常濾膜上總菌數在200以下，且大腸菌數20～30個時最適宜計數，若總菌數超過200個時，可將水樣進行稀釋後再進行實驗；另檢測濁度較高或已知有大腸菌類的水樣時，則可利用較小體積的水樣(表10.6)來進行過濾。與多管發酵法相較，濾膜法有數個優點： 短時間即可獲得實驗結果。濾膜法所需時間較短，多管發酵法完整實驗至少需要四天。 試驗所用的水量較多，增加分析時的靈敏度，同時較具有代表性，並可於取樣地點進行過濾，利於實驗進行。 培養基製備簡單。 水樣不需特別處理。 數據較精確，再現性高，利用已知體積的水樣直接計數，計算結果立即重現，不需採統計方法。 經費較為節省 濾膜法亦有以下的缺點： 待測水樣中的濁度太高(懸浮物質較多)或非大腸菌維生物數量(如藻類)過多時，不宜使用濾膜法檢測。主要原因是這些干擾物質會阻塞濾膜，無法過濾足夠的水量進行培養，且這些濾膜阻塞物質多而厚，將造成大腸菌類無法充分吸收養分。 待測水樣中若存在毒性物質(如重金屬，氯及酚類物質)，會被吸附或壓縮在濾膜上，抑制維生物的生長，造成試驗結果偏低，因此對某些特定來源的水樣(如工業區有毒廢水)應同時進行濾膜法及多管發酵法，以證明其可行性。 試驗時容易受環境汙染，使數據失去準確度。 濾膜法大腸菌群密度的計算以100ml水中總大腸桿菌群菌落數(CFU/100ml)表示之。每張濾膜以能生約50個大腸桿菌群菌落且總菌數以不超過200個菌落為最適宜。菌落數以下列公式計算之： 大腸桿菌群密度 (CFU/100ml) = 所選取之大腸桿菌群菌落數 * 100/ 所有選取之過濾水樣之體積(ml) 倘若整片或部分濾膜長滿了大腸桿菌群菌落，以致無法分開計算，其結果以”大腸桿菌群呈群集生長(Confluent growth with coliform)”表示之。若群集生長者為非大腸桿菌群，也必須以”非大腸桿菌群呈群集生長”紀錄之。遇此情況，則重新採樣檢測。若由濾膜上之菌落無法明顯計數，可用”太多無法計數(Too numerous to count，TNTC)”來表示之，或另採新水樣來檢測。當重新檢測時，可將100ml之水樣分成都多份過濾，以減少因濾膜表面菌落長得過份擁擠而造成的干擾。 干擾 （一）水樣中含有抑制或促進大腸桿菌群細菌生長之物質。 （二）檢測使用的玻璃器皿及設備含有抑制或促進大腸桿菌群細菌生長的物質。 （三）濁度過高之水樣易造成濾膜孔隙阻塞，或造成細菌菌落瀰漫生長（spreading）而影響水樣檢驗的觀察及結果的判讀。 實驗器材 （一）量筒：100 至 1000 mL 之量筒。 （二）吸管：有 0.1 mL 刻度之 10 mL 之無菌玻璃吸管或無菌塑膠製吸管，或無菌微量吸管（micropipet）。 （三）稀釋瓶：100 至 1000 mL 可滅菌、具螺旋蓋之硼矽玻璃製品。 （四）錐形瓶：200 至 1000 mL 可滅菌之硼矽玻璃製品。 （五）採樣容器：容量 100 mL 以上無菌之硼矽玻璃或塑膠製有蓋容器，使用市售無菌袋亦可。 （六）培養皿：硼矽玻璃製或可拋棄式塑膠製培養皿，大小為 60 × 15 mm、50 × 12 mm 或其他適當大小。 （七）過濾裝置：能耐高溫高壓滅菌的玻璃、塑膠、陶瓷或不鏽鋼等材質構成之無縫隙漏斗，以鎖定裝置、磁力或重力固定於底部。 （八）抽氣幫浦：水壓式或吸氣式，壓力差最好在 138 至 207 kPa 者。 （九）濾膜：使用材質為混合纖維素酯（mix