荧光PCR原理、常用探针的优缺点及多重荧光PCR技术进展.docVIP

阐述荧光PCR原理、常用探针的优缺点及多重荧光PCR技术进展 摘要：荧光PCR技术是20世纪90年代中期发展起来的一种新型核酸定量技术。该技术具有实时监测、快速、灵敏、精确等特点, 是对原有PCR技术的革新, 扩大了PCR的应用范围。本文综述了荧光PCR技术的原理、常用探针的原理和优缺点，PCR技术的研究方向及其应用。 关键词：荧光PCR;探针;多重荧光PCR;应用 聚合酶链式反应PCR是一种体外扩增DNA片断的技术，根据扩增策略和检测产物手段的不同，可分为定性PCR和定量PCR。实时PCR( rea-l time quantitative polymerase chain react ion, RQ-PCR) 又称荧光定量PCR, 是由美国Applied Bisystems 公司于1996 年研制出的一种新型核酸定量技术, 并随着荧光PCR 仪的推出而逐渐得到广泛应用[ 1]。该技术在常规PCR 基础上运用荧光共振能量转移现象( fluorescence resonance energy transfer, FRET) 技术, 加入荧光标记探针, 巧妙地把核酸扩增、杂交、光谱分析和实时检测技术结合在一起, 在PCR 指数扩增期间通过连续监测荧光信号的强弱来即时测定特异性产物的量, 并据此推断目的基因的初始量[ 2] 。 1.荧光PCR的原理 荧光PCR技术是指在普通PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累监测整个PCR反应的进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量的方法。荧光PCR技术是在常规PCR基础上，添加了一条标记了两个荧光基团的探针。一个标记在探针的5’端，称为荧光报告基团(R);另一个标记在探针的3’端，称为荧光抑制基团(Q)。两者可构成能量传递结构，即5’端荧光基团所发出的荧光可被3’端的荧光抑制基团吸收或抑制。当二者距离较远时，抑制作用消失，报告基团荧光信号增强[3]。荧光信号与PCR产物同比增长，随PCR产物的增加而增强。荧光PCR方法就是利用此原理，在PCR反应过程中，连续不断地检测反应体系中荧光信号的变化。当信号增强到某一闽值(PCR反应的前几个循环的荧光信号作为荧光本底信号，荧光闭值的缺省设置是3-15个循环的荧光信号标准偏差的10倍)时，此时的循环次数(Ct值)就被记录下来，如图1-1所示。该循环参数(Ct值)和PCR反应体系中起始模板量的对数值之间有严格的线性关系。利用阳性梯度标准品的Ct值，制成标准曲线，图1-2所示，再根据样品的Ct值就可以准确确定起始模板的数量。 2. 探针的介绍 2.1分子信标探针 Tyagi和枪ammer(1996)首次建立了分子信标探针[4]，在同一寡核苷酸探针的5’端标记荧光素、3’端标记淬灭剂(DABCYL)、、其工作原理如图1-3所示。分子信标探针能形成发夹结构，探针的朴琳环与目的DNA碱基互补，朴琳环两侧为与目的DNA无关的碱基互补的臂。无目的DNA时，探针形成发夹结构，荧光素靠近淬灭剂，荧光素接受的能量通过共振能量转移至淬灭剂，DABCYL吸收能量后以热量形式散失，结果不产生荧光。当探针遇到目的DNA分子时，形成一个比两臂杂交更长也更稳定的杂交，探针自发进行构型变化，使两臂分开，荧光素和淬灭剂随之分开，此时在紫外照射下，荧光素产生荧光。影响分子信标探针构型变化的参数主要有:臂长、臂序列GC含量、朴琳环长度和溶液盐浓度，尤其是二价阳离子如Mg2+对两臂形成的环有较强的稳定作用，在M存在条件下，4-12个核苷酸可形成稳定的杂交茎。朴琳环长度至少应是臂长的2倍，才能保证探针与目标DNA杂交及荧光素与淬灭剂分离。 分子信标为荧光淬灭探针，空间上呈发夹状，其环状部分与靶序列互补，位于茎干部分的5’和3’ 端分别标记一个荧光分子和淬灭分子。在PCR反应中分子信标与靶序列杂交，发夹结构打开而发出荧光。分子信标的特殊发夹结构使之具有高度的杂交特异性，能检测单碱基突变。在PCR产物测定、遗传分型、药物筛选、突变分析、RNA测定[5]等领域正得到迅速应用。 2.2 TaqMan探针 TaqMan探针(亦称水解探针)是一段5’端标记报告荧光基团(用R表示)，3’端标记淬灭荧光基团(用Q表示)的寡核营酸。报告荧光基团如FAM共价结合到寡核苷酸的5’端[6]。TET、vlc、JoE及HEx也常用作报告荧光基团。所有这些报告荧光基团通常都由位于3’端的淬灭荧光基团TAMRA所淬灭。TaqMan探针的工作原理如图1-4所示，当PCR反应在退火阶段时，一对引物和一条探针同时与目的基因片段结合，此时探针上R基团所发出的荧光信号被Q基团所吸收，仪器检测不到荧光信号:当PCR反应进行到延伸阶段时，Taq酶在引物的引导下，以四种脱氧核昔酸为底物，