地高辛标记系统概要.ppt

杂交液组成 5×SSC (NaCl，柠檬酸钠) 50mM PB (NaH2PO4，Na2HPO4) 5×Denhardt (多聚蔗糖，聚乙烯比咯烷酮，BSA) 2.5mmEDTA （有/无） 100ug/ml SS DNA (鲑精DNA) 0.1%SDS 10%硫酸葡聚糖（dextran sulfate） 杂交 预热一定体积的DiG Easy Hyb（10ml/100cm2膜）至杂交温度37-42 oC 。 预杂交30分钟。在不加探针的情况下，仅将膜放在杂交液中42 oC下充分润湿。（此过程可以延长至数小时） 变性：Dig标记的探针（约25ng/ml）加50μl H2O置沸水浴或98 oC干浴锅中5分钟后迅速放在冰上冷却。（不能用碱变性！） 将变性的探针加入预热的DIG Easy Hyb（3.5ml/100cm2）中，混匀，避免泡沫。 倒出预杂交液，加入探针和DIG Easy Hyb混合液。 继续在42 oC下杂交6h 至过夜（单拷贝探针）。 备注： 含有探针的DiG Easy Hyb杂交液可重复利用，杂交结束后放入离心管中于-20 oC保存，可重复使用几次，只需在使用前于68 oC处理10分钟即可 不要煮沸DiG Easy Hyb杂交液 杂交时注意事项 使用正确的杂交温度（使用DIG EasyHyb，DNA：DNA37—42oC，RNA：RNA 68oC，RNA：DNA 50oC） 为防止尼龙膜干燥，在准备好下一步处理用试剂之前不要倒掉正在用的溶液 使用合适的探针浓度 探针用之前68oC 变性 洗膜 2×SSC，0.1%SDS室温下洗涤5分钟，洗2次。 0.5×SSC，0.1%SDS 65-68℃温和摇动15分钟，洗2次。 杂交后洗膜时注意事项 如果探针与靶DNA 的同源性低于80%，热洗时应使用较低的温度（如60oC） 热洗之前应将洗膜液预热到热洗所需温度 免疫检测 试剂准备同探针标记效率测定 所有反应在15-25oC进行并轻轻摇动， 如果膜需再次使用，任何时候都不要让膜干燥 试剂准备（1） Washing buffer: 0.1M Maleic acid, 0.15M NaCl; pH 7.5(20℃); 0.3%(v/v) Tween20. 15-25℃ stable. Removal of unbound antibody. Maleic acid buffer: 0.1M Maleic acid, 0.15M NaCl; adjust with NaOH(solid) to pH 7.5(20℃)0 15-25℃ stable. Dilution of Blocking solution. Detection buffer: 0.1M Tris-HCl, 0.1M NaCl, pH 9.5(20℃). 15-25℃ stable. Ajustment of pH to 9.5. TE buffer: 10mM Tris-HCl, 1mM EDTA, pH 8.0. 15-25℃ stable. Stopping color reaction. 试剂准备（2） Blocking solution?:用Maleic acid buffer 10×稀释试剂6#（10×Blocking solution?），成1×的工作液，即每9ml 1×Maleic acid buffer中加入1ml 10×Blocking solution?混匀，现配现用。封闭膜上非特异性结合位点 Antibody solution(Ab) solution?: 将4#试剂(Anti-Digoxigenin-AP Conjugate)离心，按1：5000或1：10000加入Blocking solution，2-8 oC可放12小时。（每10ml 1×Blocking solution 加1ul Ab抗体即可）.与地高辛标记的探针结合。 Color-substrate solution（显色液）：从试剂5#(NBT/BCIP)中取100ul到5ml Detection buffer，要避光，现配现用。显示抗体结合的位点 操作步骤（室温下进行） 1．杂交和洗膜后，用Washing Buffer( Buffer1)浸泡1-5分钟 2．在50-100ml 1×Block solution（Buffer2）中处理30分钟 3．用1×Block solution（Buffer2）稀释抗体–DIG-抗原偶联物至150mU/ml（1:5000） 4．用20ml antibody solution处理膜30分钟 5．用50-100ml Washing Buffer( Buffer1)洗膜15分钟，洗2次 6．在20ml detection buffe