牛凝乳酶原基因的合成及其在乳酸克鲁维酵母中的表达.PDF

生 物 工 程 学 报 Chin J Biotech 2010, September 25; 26(9): 1281−1286 Chinese Journal of Biotechnology ISSN 1000-3061 cjb@ ©2010 CJB, All rights reserved. 工业酶与生物催化 牛凝乳酶原基因的合成及其在乳酸克鲁维酵母中的表达 1,2* 1* 1 1 3 1 袁伟 ，柯涛 ，杜敏华 ，褚学英 ，胡凡 ，惠丰立 1 南阳师范学院生命科学与技术学院，南阳 473061 2 河南师范大学生命科学学院，新乡 453007 3 湖北大学生命科学学院，武汉 430062 摘 要: 凝乳酶在奶酪加工中应用广泛，为获得高活性的凝乳酶制剂，采用乳酸克鲁维酵母为宿主，首次对经密码子 优化的牛凝乳酶原基因进行表达。利用DNAWorks3.0 软件辅助设计，用两步PCR 法合成了小牛凝乳酶原基因(GenBank Accession No. AA30448) 。将该基因插入酵母表达载体pKLAC1 ，构建了重组载体pKLAC1-Prochy ，并用电脉冲法将线 性化的重组质粒转化到乳酸克鲁维酵母GG799 中。通过含1 ％酪蛋白的YEPD 平板活性筛选，PCR 鉴定，最后获得了 一株多拷贝整合的基因工程菌chy1 。该菌株可分泌表达牛凝乳酶原，经SDS分析，证明重组牛凝乳酶原的分 子量约为41 kDa ，符合预期大小，酸化处理后为36 kDa ，证明可以正确自我剪切。液体培养96 h 后，酶活最高达到 99.67 SU/mL 。分别以半乳糖和葡萄糖为碳源的条件下表达，其酶活性差异不大，说明在发酵期间，可以不经过半乳糖 诱导即可产生高水平的牛凝乳酶原产物。该工程菌的获得为进一步优化产酶条件及放大工艺提供了条件，并为凝乳酶 的工业化生产奠定了基础。 关键词: 牛凝乳酶原，乳酸克鲁维酵母，基因合成，密码子优化 Gene synthesis of the bovine prochymosin gene and high-level expression in Kluyvermyces lactis 1,2* 1* 1 1 3 1 Wei Yuan , Tao Ke , Minhua Du , Xueying Chu , Fan Hu , and Fengli Hui 1 College of Life Science and Technology, Nanyang Normal University, Nanyang 473061, China 2 College of Life Science, Henan Normal University, Xinxiang 453007, China 3 College of Life Science, Hubei University, Wuhan 430062, China Abstract: Chymosin is an important industrial enzyme widely used in cheese manufacture. To improve expression efficiency of recombinant bovine chymosin in Kluyveromyces lactis strain GG799, we designed and synthesized a DNA sequence encoding bovine prochymosin gene (GenBank Accession No. AA3