高通量筛选吸烟人群中肺癌相关蛋白的研究.pdf

摘 要 摘 要 背景：肺癌是目前发达国家乃至全世界危害最为严重的恶性肿瘤之一。在我国，肺 癌患者每年以 26% 的速度增长，每年死亡人数高达 60 万之多。目前一致公认，肺癌与 吸烟的关系最为密切。我国现拥有全世界 1/3 的烟民，80%的男性肺癌和 19.3%的女性 肺癌都归因于吸烟，所以降低肺癌的发病率和死亡率已成为迫切需要解决的问题。而能 否早期发现、早期诊断肺癌成为提高肺癌患者生存率的关键问题。近年来已发现多种肿 瘤标志物可用于肺癌的早期诊断，但是专门针对于吸烟人群的肺癌肿瘤标志物的发现却 很少。本实验致力于应用蛋白芯片筛选吸烟人群中的肺癌特异性噬菌体克隆，为将来构 建诊断芯片从而筛选相关肿瘤标志物奠定基础。 方法：用 RNeasy Mini Kit 提取吸烟型肺癌组织的总 RNA ，分离纯化mRNA ，逆转 录合成双链 cDNA，经末端修饰、定向EcoRI/HindIII 接头连接、接头消化，使其两端分 别带有 EcoRI 和 HindIII 粘性末端。用 Mini Column 分离 cDNA 片段，收集 250 bp 以上 的双链cDNA，与 T7Select 10-3 载体连接，体外包装后，得到吸烟型肺癌组织 T7 噬菌 体展示 cDNA 文库。然后将构建的噬菌体文库进行生物淘洗，并用吸烟型肺癌患者血清、 非吸烟型正常人血清和吸烟型正常人血清分别对淘洗后的文库进行大规模的筛选，对所 得数据标准化处理，并分别对吸烟肺癌组和非吸烟正常组、吸烟正常组和非吸烟正常组 做 t 检验，以 P0.01 为差异极显著，再结合线性回归分析，在吸烟肺癌组和吸烟正常组 中都高表达，而在非吸烟正常组中低表达的噬菌体克隆即为所需的吸烟人群中肺癌相关 克隆。 结果：构建的吸烟型肺癌组织 T7 噬菌体 cDNA 文库，经测定，原库库容为 1.35× 6 pfu ，扩增后文库滴度为4.4 ×1010 pfu/ml 。PCR 鉴定从原始文库中随机挑取的 100 个 10 噬菌斑，重组率为 97%，重组体中 91%的插入片段长度250 bp 。经所建文库与蛋白芯 片结合筛选噬菌体克隆，对吸烟肺癌组和非吸烟正常组进行分析，筛选出 158 个在吸烟 肺癌组中高表达的克隆；对吸烟正常组和非吸烟正常组进行分析，筛选出 162 个在吸烟 正常组中高表达的克隆。最后，从以上两组中选出了 82 个在吸烟肺癌组和吸烟正常组 中都高表达的噬菌体克隆。 结论：成功构建了较高质量的吸烟型肺癌组织 T7 噬菌体 cDNA 文库，并通过蛋白 I 摘 要 质芯片筛选出 82 个吸烟人群中与肺癌相关噬菌体克隆，经验证，这些克隆可以用来构 建诊断芯片，并为进一步筛选吸烟人群中肺癌肿瘤标志物，及检测吸烟人群中早期肺癌 患者打下基础。 关键词 肺癌 噬菌体展示 cDNA 文库 蛋白芯片 吸烟人群 II Abstract Abstract Background: Lung cancer remains one kind of the worldwide most serious malignant tumors carcinomas in recent years. In China, lung cancer patients increase by 26% every year, and the death toll was more than 600,000. The key facter for lung cancer is closely related to tobacco smoking. Recently, our country contains 1/3 of the total worldwide smokers, with 80% of male and 19.3% of female lung canc