第二章基因工操作的工具酶(10.3.15).ppt

第二章 基因工程操作的工具酶;2.1 基因工程工具酶;1.工具酶的概念 2.限制性内切酶 3.DNA聚合酶 4 DNA连接酶 5.碱性磷酸酶 6 末端转移酶 7 核酸酶S1 8 T4多核苷酸激酶;1.工具酶的概念 应用与基因工程的各种酶的总称. 切: 连: 修饰:;2.限制性内切酶;限制性内切酶的发现;;;;限制性内切酶的定义;限制性内切酶分类;;;Ⅱ 型限制性内切酶： 3个基本的特征： ①在DNA分子双链的特异性识别序列部位切割DNA分子；识别序列的碱基数一般为4、6、8个bp,识别位点经常是一种回文序列的DNA. ;限制性酶的识别序列一般为4~8个核苷酸，这些序列大多呈回纹结构。 Eco RⅠ识别6个核苷酸序列，在特定的G-A之间切割DNA分子。 5’ … G↓A –A- T –T – C … 3’ 3’ … C – T –T –A –A↑G … 5’ ;Pst Ⅰ酶切 5’ … C – T –G –C–A↓G … 3’ 3’ … G↑A–C – G–T– C… 5’ SmaⅠ酶切 5’ … C – C– C↓ G–G – G … 3’ 3’ … G – G–G↑ C– C – C… 5’ ;;;;;限制性核酸内切酶的命名;常见的限制性内切酶 限制性核酸内切酶名称 识别序列和切割点 EcoR Ⅰ G↓AATTC HindⅡ GTPy↓PuAC Hind Ⅲ A↓AGCTT BsuR I GG↓CC;;;限制酶产生末端的连接;b、不匹配末端连接;C.平末端连接;内切酶的切割方式;;;核酸内切酶的缓冲液性质;;;大肠杆菌中的甲基化酶 dam甲基化酶: 可在5 ’ GATC3’序列中的腺嘌呤N6位置上引入甲基。 dcm甲基化酶 此酶在序列5CCAGG3或5CCTGG3中的胞嘧啶C5上引入甲基，受其影响的限制性内切酶是EcoR II。 ;3’－腺嘌呤脱氧核苷酸;N;甲基化酶在基因工程中用途: 许多II类限制性内切酶，都存在着相对的甲基化酶，它们可修饰限制酶识别顺序中的第三位腺嘌呤上，封闭酶切位点，从而使其免受切割。 ;Ⅱ型限制性核酸内切酶的反应条件 ;应注意的问题;影响限制性核酸内切酶活性的因素 ;;;;;3. DNA聚合酶; DNA聚合酶;;(2).Klenow酶：也称DNA聚合酶I大片段，Klenow片段或K1enow聚合酶。只是从DNA聚合酶I全酶中去除了5’ --3’外切酶活性。 具有5’—3’聚合酶活性； 3’—5’外切酶活性。 ;;(3)Taq DNA聚合酶;(4) 逆转录酶（依赖于RNA的DNA聚合酶） AMV逆转录酶（鸟类成髓细胞性白血病病毒） , M-MLV逆转录酶（Moloney鼠白血病病毒）。 AMV逆转录酶反应的最适温度为41～45℃，最适pH为8.3。 ;;T4噬菌体DNA聚合酶 ;;T7噬菌体DNA聚合酶 ;测序酶 ;4. DNA连接酶;;DNA连接酶的反应条件 Tris-HCl 50 - 100 mM ,pH 7.5 MgCl2 10 mM,ATP 0.5 - 1 mM,DTT 5 mM Volume: 10 - 20 μl T T:4 - 15 ℃, 4 - 16 hr 1 U DNA连接酶的酶活性：在最佳反应条件下,15 ℃反应1 小时，完全连接1 μg λ-DNA（Hind III片段）所需的酶量.;平头双链DNA片段的连接操作 粘性末端的连接属于分子内部的连接. 平头末端的连接属于分子间的连接，反应速度慢. ;;5. 碱性磷酸酶;分类： （1）BAP(bacterial alkaline phosphatase） :细菌碱性磷酸酶，来源于大肠杆菌 。 活性高，但耐高温和去污剂，抑制其活性较难。 （2）CIP（calf intestinal alkaline phosphatase ）:牛小肠碱性磷酸酶，来源于小牛肠 。 蛋白酶K消化，EDTA参与下，65℃加热1小时灭活。 ;;6.末端转移酶;;7.核酸酶S1;S1核酸酶降解单链DNA或RNA,产生带5’磷酸的单核苷酸或寡核苷酸。需要辅助因子Zn。 用途： (1) 去除DNA片断中突出的单链尾以产生平端。 (2) 打开双链cDNA合成中产生的发夹。 ;带切口的双链DNA S1核酸酶;8 .T4噬菌体多核苷酸激酶 催化ATP的γ-磷酸基团转移到DNA或RNA的5’末端。 来源于T4噬菌体感染的大肠杆菌细胞。已在多种哺乳动物细胞中发现了多核苷酸激酶。 ;;9.