丝氨酸526位点在MEKK3介导的IL 1信号途径中的作用论文.docVIP

　　丝氨酸526位点在MEKK3介导的IL 1信号途径中的作用论文 【摘要】目的：确定MEKK3分子中介导IL1信号途径的关键性氨基酸.方法：对哺乳动物MEKK3活性环526位点的丝氨酸进行人工诱变后，用瞬时转染的方法分别将526A基因单独及与TRAF6基因同时导入GES1细胞中；用免疫印迹、NFκB荧光素酶报告基因测定及免疫沉淀实验检测了526A突变体的表达水平、对IL1及TRAF6介导的NFκB基因的表达及MEKK3与TRAF6相互作用的影响.结果：通过与野生型MEKK3的对比，观察到526A不但阻断了IL1及TRAF6介导的依赖于MEKK3的NFκB基因的激活，同时阻断了TRAF6与MEKK3的相互作用.结论：526位点的丝氨酸在MEKK3介导的IL1信号途径中起关键性的作用，是不可缺少的关键性氨基酸. 【关键词】有丝分裂原激活的蛋白激酶突变体TRAF6NFκB白细胞介素1信号传导 0引言 有丝分裂原激活的蛋白激酶（Mitogenactivatedproteinkinase,MAPK）信号转导途径，对细胞的炎症性反应、生长、分化、繁殖和生存等起重要的调控作用［1］.MAPK和ERK的上上级激酶3（MEKK3），是一种丝氨酸/苏氨酸的MAP3K，已被证明不但是TNFα,IL1和LPS诱导的NFκB激活的重要调控激酶［2-3］.freeline、抗HA和抗Flag(M2)mAb、重组人IL1β、双重荧光素酶报告测定试剂盒、HRP结合的羊抗鼠IgG二抗、NC膜、化学发光底物、X光片、预染蛋白质标准、DMEM细胞培养液及胎牛血清分别购自Nea,PeproTech,Promega,SantaCruz,AmershamBioscience,KPL,Kodak,Fermentas,Gibco和四季青公司；Orion微板化学发光测定仪为Bertholddetectionsystems产品. 1.2方法 1.2.1526Ser→526Ala人工突变体的制备MEKK3活性环526位点的丝氨酸突变为丙氨酸的人工突变体526A的制备按美国Stratagene公司提供的QuikChange定点诱变的方法进行：以HAtaggedSRα3MEKK3质粒DNA作为模板，合成1对含诱变位点的互补引物：5′cagaccatctgcatggcagggacaggcattc3′和5′gaatgcctgtccctgccatgcagatggtctg3′（划线部分为诱变位点的丙氨酸密码子），用PfuDNA聚合酶进行快速PCR定点诱变.PCR条件：95℃30s后，按95℃30s，55℃1min和68℃12min顺序，共25循环.诱变产物经DpnI在37℃作用1h，酶切除去野生型的模板DNA后，直接转化入E.coliXL1Blue感受态细胞，获得的人工突变体526A质粒DNA送公司测序鉴定. 1.2.2细胞培养和瞬时转染或共转染实验在37℃含有50mL/L的CO2的培养箱中，用含100mL/L的胎牛血清的DMEM细胞培养液培养人胃黏膜GES1细胞.在瞬时转染前24h，对GES1细胞进行定量培养，用Lipofectamine按制造商提供的方法及用量，将质粒DNA转染入GES1细胞中，并设不含质粒DNA的对照管.共转染除了必须同时将等量的两种或三种或四种DNA在同一试管内混合外，其余方法同上. 1.2.3EKK3或526A进行共转染、或分别将NFκB报告基因与MEKK3+TRAF6或526A+TRAF6共转染入GES1细胞内，同时转染入GES1细胞的还有βactinrenilla荧光素酶DNA作为转染效率的控制，用双重荧光素酶报告基因测定试剂盒按说明进行相对荧光素酶活性测定.在转染质粒DNA后24h,.freelL/每孔(6孔板).每样本取0.4mL裂解液与抗体反应4h后,加入蛋白A琼脂糖珠继续反应1h以沉淀表达的蛋白抗体复合物.（同时取20μL的样本进行免疫印迹测定，以验证目的蛋白的表达.）用同样的裂解液洗蛋白A琼脂糖珠4次，最后用1×SDSPAGE上样缓冲液将表达的蛋白抗体复合物自蛋白A琼脂糖珠上洗脱下来后，加样于SDSPAGE胶上，进行与方法1.2.3相同的EKK3526位的碱基序列已由原来编码丝氨酸的tca成功地改变为编码丙氨酸的gca.在GES1细胞转染了526A质粒DNA36h后，用r约74×103的526A特异表达的+HA标记基因表达的融合蛋白质条带，与理论计算的MEKK3活性环526位点的丝氨酸突变为丙氨酸的人工突变体526A的分子质量相符. 1:未转染时的阴性对照;2:526A;3:转染了野生型HAMEKK3的对照. 图1EKK3的NFκB报告基因的表达当GES