第二章 蛋白质 N端测序技术介绍.pdf

蛋白质N端测序技术介绍 蛋白质N端测序技术介绍 中科大生命学院实验中心 施荣华 中 1 蛋白质测序的发展简史 蛋白质测序的发展简史 自从1967年Edman本人推出的第一台自动测序仪来，经历了液相 测序仪—— 固相测序仪——气相测序仪的发展历程。 液相测序：样品一直处于溶液状态，样品没有耦联到任何载体上，样 品容易损失。 固相测序：将蛋白质共价耦联于聚苯乙烯膜，微孔玻珠或PVDF膜上再进行 序列分析的方法。此方法可避免因冲洗而使样品损失，同时在序列降解及冲 洗步骤采取较剧烈的条件。 气相测序：蛋白质通过polybrene等载体吸附在化学惰性的玻璃滤膜 上，偶联碱和裂解酸以气相方式转运，反应副产物和ATZ氨基酸通过有机溶 剂以气相方式萃取,蛋白质本身不会丢失. 2 蛋白质和DNA测序比较 蛋白质和DNA测序比较 3 蛋白质N-端测序优劣势 蛋白质N-端测序优劣势 随着分子生物学的飞速发展，一种新的革命性的测定蛋 白质顺序技术手段--DNA测序技术。它是根据已经测定部分 氨基酸序列设计引物，扩增出其mRNA，从而推出蛋白的全 序列技术. 从前面蛋白质测序和DNA测序比较,DNA测序比蛋白质 直接测序有明显优势 （蛋白测序的劣势：昂贵 费时 封闭 不能测定 ） 但是通过测定基因编码导出氨基酸序列并不完全描述 蛋白质的一级结构，蛋白质的直接测序仍有DNA测序具有 的优势。 （1） 确认某些蛋白质信号肽的起始和终点 （2 ） 确认转译后被加工的氨基酸的位点 4 蛋白质N-端测序优势 蛋白质N-端测序优势 （3 ）通过验证DNA测序得到蛋白质序列的正确性 （4 ） 检验基因工程表达的结构，为寡聚核苷酸探针与引 物合成提供依据 （5 ） 测定活性多肽和小蛋白质序列更简捷 （6 ） 联合质谱技术，确认S-S定位，位点的修饰(还原剂三 羧甲基磷酸ＴＣＥＰ，烷化剂碘乙酰胺ＩＡＡ) 5 蛋白质，DNA 和质谱测序技术比较 蛋白质，DNA 和质谱测序技术比较 （1）蛋白质测序： N-端测序和C-端测序，Edman不能 解决N端 封闭肽的测序问题 （２）ＤＮＡ测序：对于转译后加工所导致的氨基酸残基的修饰 无能为力。 （３）质谱测序：８０年代末出现的２大技术:电喷雾（ESI, electrospray ionization)质谱和基质辅助激光解吸电离－飞行时间 （MALDI-TOF ,matrix-assisted laser desorption/ionization time –of- flight),采用软“ 电离” 的电离方式。需求样品量少，速度快，价格 昂贵。 6 蛋白质N-端测序- Edman降解法