荧光实时定量PCR技术初探(附件).PDF

生命科学趋势 2003 年 12 月 第 1 卷 第 4 期 Trends in Life Sciences 荧光实时定量 PCR 技术初探 张鋆 （责任编辑：xmale ） 摘要：少量的 DNA 序列的准确定量曾经是一件很难很累的事情，不过 real time PCR 的出现把它变为和普通PCR 差不多一样容易。原理是利用能特异标记 PCR 产物的荧光物质，显示 PCR 产物的动态累积，得到 S 型的扩增曲线；假设该曲 线的前期 PCR 符合指数性扩增，于是在单纯指数方程的基础上，通过比较产物 积累的速度（时间）来间接比较（进而确定）初始模板的分子数。我们试验了标 准曲线的制作，以及对免疫相关的目的基因 IL-4 转录水平的定量，而且用 HPRT 持家基因对 IL-4 进行归一化。结果与 RT-PCR 相近。灵敏度，误差降低，可重 复性有望更上一层楼。 关键词：real time PCR 定量 荧光 SYBR 扩增曲线 标准曲线 cDNA Abstract: It had been difficult and tiring to quantitate a small amount of DNA until the invention of real time PCR technique, which is as easy as regular PCR. It produces and displays the kinetic accumulation of PCR product (or amplicon)called amplification curve. Assuming that amplicons are amplified exponentially during the earlier cycles, we make use of the simple equation y=ax to compare the start copy number of a gene in different samples, by measuring the threshold cycle (Ct). And with some standard, copy number of a gene can be quantified. In this experiment we tried making some standard curves. Then we quantified IL-4 cDNA in 3 subsets of T helper cell, normalized by HPRT housekeeping gene. The result correlates with RT-PCR. However, sensitivity, deviation and precision still need to be improved. Key word: real time PCR quantitation fluorescence SYBR Green I amplification curve standard curve cDNA 收稿日期：2003-10-10 ；接受日期：2003-10-15 作者简介：张鋆，生物技术专家。 1 生命科学趋势 2003 年 12 月 第 1 卷 第 4 期 Trends in Life Sciences 1 前言 1.1 发明 荧光实时定量 PCR ，由美国应用生物系统公司（AppliedBiosystems ） 在 1996 年发明。除了 real time (quantitative) PCR ，有人也称它为kinetic PCR 。 顾名思义，它不单指数性扩增（已知部分序列的目的）DNA ，而且通过检测每 个循环 PCR 产物的总累积量（借助荧光标志），可以达到很好的定量结果。 图 1：ABI