中图版必修一422细胞凋亡(课件).ppt

肿瘤的疗效判定应考虑到： ①、是否经过治疗后发生凋亡，这是肿瘤化疗效果好坏的关键之一； ②、增加凋亡指数（Apoptosis Index）与增生指数(proliferatory Index)的比值AI/PI，已成为新的治疗目标； ③、同时能否诱导细胞凋亡已成为筛选抗癌药物的新标 准； ④、诱导细胞凋亡的治疗将是对肿瘤治疗方法的重要补充与革新。 目前治疗肿瘤的新设想——在肿瘤治疗中诱导凋亡。 1、导入P53（野生型WT）抑制肿瘤增生； 2、下调突变型P53, BCl-2的活性与表达，减弱其对细 胞凋亡的抑制； 3、抑癌基因引入瘤细胞，降低致瘤性，使肿瘤细胞逆转为正常细胞； 4、引入某些细胞因子，抑制肿瘤恶性表型，使细胞丧失致瘤性； 5、应用点突变技术，使异常表达癌基因失活或修复突变基因； 6、导入药物敏感基因，有助于细胞凋亡； 九、凋亡与其他疾病 1、细胞凋亡异常增加（不该死的死了） ①神经系统退行性变：a、老年性痴呆；b 色素性视网膜炎；c、帕金氏综合征 ②骨髓发育不良综合征（恶性贫血） ③缺血性损伤：心肌梗死；缺血缺氧性脑病；肾小球肾炎 ④肝病变：病毒性肝炎和酒精性肝炎 ⑤AIDS 2、细胞凋亡过度减少（该死的不死）： ①自身免疫性疾病：a、系统性红斑狼疮（SLE） ； b、肾小球肾炎（GN）等 ②肿瘤：a、激素依赖性肿瘤（乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌）；b、造血系统肿瘤（淋巴瘤、白血病）等 ③各种病毒感染：腺病毒、疱疹病毒、痘病毒等 十、凋亡的检测方法 1972年keer提出细胞凋亡的概念， 1980年用电泳检测细胞凋亡，并证实了DNA断裂的特征。 1986年在秀丽降杆线虫（caeovhabditis elegan）中观察1090个体细胞，其中131个细胞在发育过程中通过凋亡而消失，并找到两个基因ced3 、ced4，他们的表达与细胞凋亡密切相关，故称为死亡基因。因此细胞凋亡的检测经历以下几个过程； 从单纯形态学辩认→形态与生化结合→形态、生化、分子生物学技术相结合的多种手段。 （一）凋亡检测要解决的问题是： 1、被研究体系中是否有凋亡发生，即定性。 2、凋亡的发生率，显示群体细胞的量度。这是一个相对的概念，应同时结合细胞群体的增殖率来分析，则更客观，更能反应细胞群体的生长状态。 3、了解细胞凋亡的严重度，以反应凋亡的阶段。 （二）检测细胞凋亡各种形态学方法比较 检查方法 可鉴定凋亡细胞的特征 光学显微镜（LM） 细胞缩小、核浓缩、细胞周围透明圈 相差显微镜（PCLM） 细胞鼓泡，凋亡小体 透射电镜（TEM） 微绒毛消失、核染色质沿核膜分布 新月体形成、凋亡小体 激光共聚焦（CLSM） 凋亡细胞固缩染色质及核碎片定位 扫描电镜（SEM） 细胞表面泡状突起 流式细胞仪（FCM） 低前向散射光、高侧向散射光 缩时摄影术（TLP） 凋亡细胞的形成过程 2、流式细胞仪检测 细胞凋亡时膜通透性增加介于正常细胞与坏死细胞之间，用荧光素染色细胞悬液，利用流式细胞仪测量细胞悬液中的细胞荧光强度来区分正常细胞、凋亡细胞、坏死细胞。常用Hoechs-PI染色，正常细胞对染料拒染，荧光着色淡。凋亡细胞主要摄取Hoechs染料呈强蓝色荧光。坏死细胞DNA有强的嗜PI性呈强的红色荧光。 3、核酸电泳检测细胞凋亡 （DNA片断检测细胞凋亡） 细胞凋亡和坏死时，细胞中DNA发生断裂，小分子DNA片断增加，高分子DNA减少，胞浆内出现DNA片断，然而凋亡细胞的DNA断裂是由内源性的内切酶作用，断点都是规律性的发生在核小体之间，因此出现180-200bp及其倍数的DNA片断。坏死细胞的DNA片断是无特征的杂乱片断。在凝胶电泳中出现的特征性的泳带可以判断凋亡细胞，这方法缺乏定位特性，无法确定哪个细胞发生凋亡。 4、酶联免疫吸附法(ELISA 法) ELISA 方法检测细胞凋亡后形成的由组蛋白及DNA片断组成的核小体。此方法敏感性高， 所需细胞数少， 可检测低至5×102/m L 的凋亡细胞。此外， 此方法不需特殊仪器， 比较适合基层工作。 缺点: (1)不能精确测定凋亡发生的绝对量;