蛋清溶菌酶的研究.doc

1 前言 1.1 溶菌酶 溶菌酶(Lysozyme, EC) 又称细胞壁溶解酶（Muramidase）是一种细胞非特异性免疫蛋白，是由英国细菌学家弗莱明 (Fleming)在 1 92 2年在人的眼泪、唾液中发现的。广泛存在于生物体的体液和组织液中，包括植物汁液、动物分泌液、人的眼泪、唾液、乳汁、禽蛋及部分细菌中。其中人溶菌酶的活性是最高的，大约为鸡蛋清溶菌酶酶活力的3倍。但是蛋清中溶菌酶含量最丰富，约为 0.3%-0.4%左右，而且蛋清来源广泛，因此多数商品溶菌酶是从蛋清中提取的。它是一种作用于微生物细胞壁的胞壁质水解酶，根据作用的微生物的种类不同，可分为细菌细胞壁溶菌酶和真菌细胞壁溶菌酶。根据作用位点不同，细菌细胞壁溶菌酶可分为：水解肽聚糖主链的 N-乙酰胞壁酸和 N-乙酰葡糖胺之间 β-1, 4 糖苷键的胞壁质酶作用于肽聚糖侧链酰胺键的酰胺酶，和作用于肽链尾端的内肽酶，具体见图 1-1。根据来源不同可分为：T4 噬菌体溶菌酶、植物溶菌酶、微生物溶菌酶和动物溶菌酶，其中动物溶菌酶又细分为：C 型(chicken-lysozyme type)、G 型(goose-type)和 I 型(invertebrate-type)溶菌酶。人们根据溶菌酶的溶菌特性，将其应用于医疗、食品防腐及生物工程中，特别是在食品防腐方面，以代替化学合成的食品防腐剂，具有一定的潜在应用价值。本文中选取来源于鸡蛋清中的溶菌酶即 C 型溶菌酶。 图 1-1 胞壁质水解酶的类型及其水解位点 Fig 1-1 Types of Murein hydrolases and their catalytic sites on peptide. 1.1.1鸡蛋清溶菌酶的物理化学性质 鸡蛋清中约含有0.3%的溶菌酶，可分解溶壁小球菌、芽孢杆菌等革兰氏阳性菌，但对革兰氏阴性菌基本上不起作用。当有EDTA存在时，某些革兰氏阴性菌也可以被该酶分解。 鸡蛋清溶菌酶是动植物中溶菌酶的典型代表，也是目前了解最清楚的溶菌酶之一。此酶为白色、无臭结晶粉末 ,味甜，易溶于水，遇碱易破坏，不溶于丙酮、乙醚中。蛋清溶菌酶占蛋清总蛋白的 3.4%~3.5%，由 18 种 129 个氨基酸残基组成，分子量为 14.4 kDa，等电点为 11.1，最适温度为 50 ℃，最适 pH 值为 6~7，其化学性质非常稳定，在 pH1.2~11.3 范围内剧烈变化时，结构仍稳定不变。遇热也比较稳定，在 pH4~7、100 ℃处理 1 min 后活性基本不变，是一种稳定的碱性蛋白质，但在碱性条件下热稳定性较差。 1.1.2蛋清溶菌酶的结构和功能 蛋清溶菌酶的构象比较复杂，α-螺旋仅占 25%，同时存在着伸展的 β-片层结构，其分子是由 129 个氨基酸残基排列构成的单一肽链，溶菌酶的分子结构见图 1-2。 图 1-2 溶菌酶的分子结构示意图 Figure 1-2 Molecule structure of Lysozyme. 它具有 4 对二硫键(6Cys–127Cys, 30Cys–115Cys, 64Cys–80Cys 和 76Cys–94Cys)，这几对二硫键在经变性剂或热处理后均能保持稳定，但是很容易被还原剂破坏溶菌酶的活性位点为 35 位的谷氨酸(Glu35)和 52 位的天冬氨酸(Asp52)。一般认为蛋清溶菌酶具有胞壁质酶活性，即通过活性中心 Glu35 和 Asp52 的作用，催化水解 N-乙酰胞壁酸和 N-乙酰葡萄糖胺之间的 β-1, 4 糖苷键。Glu35 作为糖苷键的质子供体，剪切底物的 C-O-C 键，Asp52 处在一个明显的极性环境中，参与生成糖基酶中间体，然后与水分子发生反应，水解生成产物。溶菌酶通过此胞壁质酶活性，破坏细胞壁的肽聚糖，导致细菌细胞壁的逐渐瓦解，内容物外流，从而最终导致菌体死亡。 1.2溶菌酶的应用 1.2.1 溶菌酶在食品工业上的应用 ①溶菌酶用于水产类熟制品、肉类制品的防腐和保鲜 溶菌酶可作为鱼丸等水产类熟制品和香肠、红肠等肉类熟制品的防腐剂。只要将一定浓度（通常为0.05%）的溶菌酶溶液喷洒在水产品或肉类上，就可起到防腐、保鲜的作用。 ②用于新鲜海产品和水产品的保鲜 一些新鲜海产品和水产品在0.05%的溶菌酶和3%的食盐溶液中浸渍5min后，沥去水分，进行常温或冷藏贮存，均可延长其贮存时间。 ③在糕点和饮料上的应用 在糕点中加入溶菌酶，可防止微生物的繁殖，特别是含奶油的糕点容易腐败，在其中加入溶菌酶也可起到一定的防腐作用。在pH值6.0~7.5的饮料和果汁中加入一定量的溶菌酶具有较好的防腐作用。 ④在保健食品添加剂上的应用 溶菌酶是高盐基蛋白质，具有一定的保健作用；有抗感染及抗生素效力增强作用，有血液凝固和止血作用，有组织再生和形成促进作用等。 1.2.2