T细胞淋巴瘤中EB病毒的检测.docxVIP

联合显微切割及PCR方法对结外NK/T细胞淋巴瘤中EB病毒的检测　　摘要：目的：研究结外鼻型NK／T细胞淋巴瘤中EB病毒基因的表达。方法：筛选NK／T细胞淋巴瘤56例，应用手工显微切割进行组织纯化后，用PCR检测EBV的基因序列，并同时对相应组织用EBV抗体做免疫组织化学染色检查，对两种方法进行了比较。结果：56例NK／T细胞淋巴瘤应用手工显微切割进行组织纯化后，用PCR方法EBV阳性率为39／56(69.64％)，而用免疫组化方法阳性率为7／56(12.50％)，二者检出率有显著差异。结论：显微切割联合PCR技术能明显提高EB病毒检出率和准确性，是检测EBV的有效方法。　　关键词：鼻NK／T细胞淋巴瘤；EB病毒；手工显微切割；聚合酶链反应　　中图分类号：R373.9；R733.4　文献标识码：A　文章编号：1008－2409(2007)04－0678－03　　　　淋巴瘤是淋巴细胞单克隆增殖性疾病，由于瘤细胞的发生和发展重演了B、T细胞各阶段的发育，其形态学和遗传学改变表现出高度的异质性及组成成分的复杂性，成为困扰淋巴瘤诊断的主要原因。PCR检测淋巴细胞单克隆增殖性疾病失败的原因之一可能与送检标本中包含肿瘤细胞的多少，间杂坏死组织和多种炎症细胞背景有关。根据组织纯化的原理，在HE染色或亚甲蓝等染色下，用显微切割的方法直接分离出肿瘤细胞，再联合PCR技术，排除了非肿瘤细胞基因组DNA的影响．可以提高PCR检测阳性率和准确性。结外NK／T细胞淋巴瘤鼻型是2001年WHO正式命名的新的淋巴瘤亚型，亚洲多发，在中国特别是南部地区多发。本研究应用手工显微切割(hand－made microdissection)及聚合酶链反应(poly－merase chain reaction，PCR)技术检测结外NK／T细胞淋巴瘤(nasal NK／T－cell lymphoma，NKTCL)病变中EB病毒(Ep－stein Barr virus，EBV)基因的存在情况，并同时对相应组织用EBV抗体做免疫组织化学染色相比较。　　　　1　材料与方法　　　　1.1　材料来源　　收集2001年1月至2006年3月桂林医学院及广西医科大学鼻部非霍奇金氏淋巴瘤外检病例，复习形态学、免疫组织化学(CD3e、CD45RO、CD20、CD56、GrB、LMP－1等)，根据2001年WHO关于淋巴造血组织肿瘤分类结外鼻型NK／T细胞淋巴瘤诊断标准筛选，对形态学较符合但免疫组化不全或不符者重做免疫组化，共选出符合结外NK／T细胞淋巴瘤病例56例。选出鼻咽部慢性炎性组织20例做对照。　　　　1.2　研究方法　　1.2.1 免疫组织化学方法 根据福州迈新生物技术开发公司推荐的免疫组化EliVisionTMplus法EBV抗体浓度为1:50。　　阳性判定标准：以胞膜棕黄色和胞浆点状棕黄色为EBV阳性。用已知EBV阳性的霍奇金淋巴瘤(HD)作阳性对照，用PBS缓冲液代替一抗作阴性对照。免疫组化阳性判断标准：肿瘤细胞阳性表达数≥10个／HP者，均视为阳性病例。阳性信号位于细胞膜，呈棕黄色。　　1.2.2　显微切割①选取相应石蜡组织，按常规切取石蜡切片，连续切片，平铺于普通未涂胶的载玻片上，厚5μm②切片经常规的苏木精一伊红(Hematine－Eosine，HE)染色，不加盖载玻片；③用手工操作显微切割法：用手术刀片和9号注射针头配合应用，将切片放在显微镜载物台上，找到要切割的细胞，在低倍镜下，手持刀片在被切割细胞周围来回刻划，切挖直至与周围组织分离；用针头蘸少量粘合剂，渐渐接近被切割细胞，小心让其表面粘合剂与被切割细胞接触，由于二者粘合力较细胞与其下方的载玻片的粘合力大，抽回细针时，其尖端的细胞也随之被取出来，然后直接将细针连同其上粘附的细胞放入准备好的EP管中，继续其后的试验。　　1.2.3 DNA提取和纯化①将提取物加入新鲜配制的PK缓冲液(10mmol／L Tris，HCI，pH8.0；1mmol／L EDTA，pH8.0；1％SDS)190μl+5／11蛋白酶K(20mg／L Protease K，PK)，70℃水浴1h。②追加10μl PK(20μg／μl)，置55℃温箱过夜。③加入等体积酚氯仿异戊醇溶液，混匀，13000rpm离心10min，取上层水相置另一离心管。④重复步骤3一次。⑤加入1／2体积醋酸铵+2.5倍体积无水乙醇，混匀，置－20℃过夜。⑥离心，13000rpm离心10min，倒弃液体。⑦加入75％乙醇，混匀，13000rpm离心10min，倒弃液体，晾干。⑧加入50μl双蒸水，溶解20min，置－20℃保存。核酸测定仪上测定DNA浓度及吸光度比值，A260／A280比值在1.60以下者弃用。　　1.2.4 PCR 参考文献选取EBV特异性基因片段作为引物