流式细胞术在植物领域中的应用.PDF

流式细胞术在植物领域中的应用 刘晓萍 Beckman Coulter 生命科学部 E-mail:xliu2@B 流式细胞仪是如何工作？ 流式细胞仪通过激光激发高速流动细胞或微粒所携带的荧光染料或荧 光素，并检测由此产生的微粒的各种光信号，如散射光、自发荧光、 特异性荧光的强弱，来反映各项待检测指标。 样本要求为单细胞悬液，不能有团块。 流式分选原理 流式细胞仪可以做什么？ 散射光信号 细胞大小 细胞粒度、细胞表面面积 荧光信号 总荧光强度（Aera or Integrea） 最大荧光强度（Height） 荧光照射时间（Width） 通过特异性荧光染料可以知道 DNA、RNA、蛋白质、膜蛋白含量 胞内or膜上 流式在植物中的应用 分析分选 •孢子Microspores 、花粉pollen •原生质体 Protoplast •细胞核 Cell nuclei •染色体 Chromosomes •叶绿体 Chloroplasts 研究植物细胞的最重要手段：原生质体 种子:50%漂白剂20min-96%酒精消毒-ddH2O洗涤-平板培养18hr light/6 dark 22℃ 根尖:剪切，protoplasting solution ： 1.25% (w/v)cellulase, 0.3% (w/v) macerozyme, 0.4 M mannitol, 20 mM MES, 20mM KCl, pH 5.7, with Tris-HCl, pH 7.5; heat for 10min at 55℃, cool to room temperature; 0.1 % (w/v) bovine serum albumin, 10mM CaCl2, and 5mM β-mercaptoethanol 融合方法： • 无机盐诱导融合 • 高pH-高Ca离子 • 聚乙二醇（PEG）法 • PEG结合高钙-高pH诱导法 • 电融合技术 原生质体分离方法 1.机械法 2.酶解分离法 分离原生质体 1.撕叶下表皮 2. 酶解 将撕去下表皮的叶片剪成小块，放在盛有5mL酶液的小培养皿中 让去除下表皮的一面接触酶液，辅满一层，在25~28℃下酶解60~90分钟 3.收集纯化 （1）用吸管将酶解液吸至5mL离心管中，以600rpm离心5分钟以上，使原 生质体沉降 （2）将上清（酶解液）回收，剩下原生质体及残渣于管底 （3）加氯化钙液约2mL，轻轻吹打均匀 （4）用注射器向离心管底部缓缓注入蔗糖约2—3mL，出现下部蔗糖液， 上部原生质体悬浮液 （5）以600rpm离心10分钟，在两液相之间出现一条绿色带，便是纯净的 原生质体 影响原生质体数量和活力的因素 植物原生质体分选 Flow sort GFP labeled protoplasts, utilizing cell type-specific promoters to drive expression of GFP only within particular cells. 报告基因系统: GFP YFP RFP GFP-expressing protoplast used for flow sorting. 植物细胞生长，增殖及应激反应的分子生物学方面的研究 Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) 研究蛋白相互作用的有 效手段 原理：两个待测蛋白基因分别与Yellow Fluorescence Protein (YFP) 的N端 152aa，C端融合，转染至植物原生质体中表达，若待测蛋白之间有相互作用 能重建YFP稳定的荧光。在流式上以488nm激发原生质体，在FL1和FL2上去 评估YFP荧光（FL1 505-554nm），原生质体自发荧光（FL2 555-605nm） 对拟南芥的Heat shock factors (Hsfs)的研究 Heat shock factors (Hsfs)是真核细胞应激反应的重要调节因子，通过结合靶基 因的启动子