生化分析方法(熊)指南.ppt

什么叫生化分析 什么叫生化分析，我们可以这样理解：用生物、化学的原理和方法，研究生命现象的分析方法。研究生物体的化学组成、代谢、营养、酶功能、遗传信息传递、生物膜、细胞结构及分子病等等，阐明生命现象。 生化分析是进行生命科学研究的一个重要手段，在生物医药研发、临床生化诊断、生化产品生产等领域起着越来越重要的作用，是一门理论与实践相结合的综合性技术。 发展进程 从早期对生物总体组成的研究。 进展到对各种组织和细胞成分的精确分析。 目前正在运用诸如光谱分析、同位素标记、X射线衍射、抗原抗体反应、酶交联的免疫吸附法、其他物理学、化学技术，对重要的生物大分子（如蛋白质、核酸等）进行分析，以期说明这些生物大分子的多种多样的功能与它们特定的结构关联 对不同的对象，有不同的分析方法，要达到不同的目的，也要使用不同的分析方法，因此分析方法也就多种多样，在这里我就讲蛋白质的分析方法概述，抛砖引玉 氨基酸蛋白质的分析方法 生物体中广泛存在的一类生物大分子，由核酸编码的α氨基酸之间通过α氨基和α羧基形成的肽键连接而成的肽链，经翻译后加工而生成的具有特定立体结构的、有活性的大分子。泛指某一类蛋白质，与前面的限定词组成复合词时，一律用“蛋白质”，如血浆蛋白质、纤维状蛋白质、酶蛋白质等，此时“质”字不得省略(习惯词除外，新命名者从此)。凡指具体蛋白质时，“质”字可省略，如血红蛋白、肌球蛋白等。 1.氨基酸类药物分析 药典中氨基酸含量测定大多应用化学滴定法,只有美国药典中乙酰半胱氨酸采用高教液相色谱法( HPLC ) 。 1.1柱前衍生法 柱前衍生法是将样品制成适当的衍生物再进行HPLC分离，衍生化的结果不仅仅改善了被测物的检测特性，有时对其色谱分离也有一定的帮助 ，常用 衍生化试剂有邻苯二 甲醛、羟基琥珀酸亚胺一 吲哚乙酸(SIIA)、苯氨基硫代甲酰酯(PTC)。有科学家分别用亚硝酸和 N 芘基马来酰亚胺作为衍生化试剂．以紫外和荧光作检测的反相高效液相法(R PHPLC) 定量测定人体内乙酰半胱氨酸，获得到满意结果。 1.2柱后衍生法 柱后衍生法是将样品先经色谱柱分离， 柱后再进行衍生。Nozal等将乙酰半胱氨酸经RPHPLC分离后，用二硫硝基苯酸衍生处理再进行检测， 同时加入溴化十六烷基三 甲铵阳离子以增强灵敏度，检测限为0.6μg 。得到了满意的结果 1.3其他衍生方式 除了以上两种经典衍生方式外，最近有文献 “介绍了用于定量分析氨基酸的一种毛细管柱内衍生方法，可在缓冲液中加入衍生剂(Online法)， 也可在毛细管前端的衍生室进行反应(Sandwich法)，这种方法与柱前衍生法检测水平相当( 微克级) 此外， 还可用蒸发光散射检测器直接检测非衍生化的氨基酸，配合HPLC的分离定量， 检测限达 纳克级 ， 回收率为9 4% 2 酶类分析 酶的种类极多， 目前研究发现的酶已达 1300多种，它们都是机体细胞中合成的蛋白质，具有高度的催化作用及选择性；虽为活体产生，但 自活体提出后 ，仍不失其催化活性个，因此某些酶经提取后，可作 为药用。 现有药用酶制剂已达100种， 。 · 酶类药物分析基本上还是应用生化反应方法，生化物质为底物，辅以紫外分光光度法 (UV) ，反映酶解反应的程度 ， 测定酶效价。映酶解反应的程度 ， 近年来， 人们尝试用一些新的生化反应底物使反应更加灵敏和准确 超氧化物歧化酶 超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase，简称SOD)是一种十分重要的生物体防止氧化损伤的酶类，是生物体内超氧阴离子清除剂，保护细胞免受损伤。SOD广泛存在于各类生物体内，所有好氧微生物细胞中都含有SOD。自1969年Mccord等人首次发现了SOD生物活性后，医学界对其医疗作用做了许多研究，证明它具有抗衰老、抗肿瘤、抗辐射、抗缺血、提高人体免疫力等作用，被专家称为21世纪最有前途的药用酶。欧美国家已开始将其应用于医疗、食品、保健、化妆品等领域。 【酶活测定】在25℃ 4.5ml 50mmol／L pH8.3的K2HPO4- KH2PO4缓冲液中加入待测SOD样液，再加入10ul 50mmol／L的连苯三酚，迅速摇匀，倒入光径lcm 的比色杯，在325nm波长下每隔30s测一次A值。同时测定Sigma公司的SOD标准品，对所测样品SOD活性进行校正。 【酶活定义】在1ml反应液中，每分钟抑制连苯三酚自氧化速率达50％时的酶量为一个酶活单位， 即325nm 0.035OD／min为一个酶活单位。 Jones应用硫代氨基甲酰--酪蛋白荧光底物使胰蛋白酶、胃蛋白酶的检测灵敏度提高了几十倍； 张东裔等以对甲苯磺酰基精氨酸甲酯(TAME ) 为底物，以 苯酚红指示剂在特定波长下光吸收值的变化作为测定胰蛋白酶效价的指标， 相对于药典中以