蛋白质结构与功能2—培训课件.ppt

* 研究蛋白质的结构、性质和功能，首先需要得到纯的蛋白质样品。 1. 蛋白质来源：微生物、动物或植物细胞； 2. 分离纯化过程中需随时测定蛋白活性并检测其含量; 3. 分离和纯化过程须在温和的条件下进行。 蛋白质分离纯化的基本原则. 1、选择丰度高、便于提取的材料. 2、了解目的蛋白质的稳定性. 3、探索有效的抽提法和浓缩法. 4、建立一套层析的组合. 5、以较好的方法贮存. * 蛋白质胶体溶液与氯化钠等真溶液不同之处在于：蛋白质在强大离心场中，在溶液中会逐渐沉降，各种蛋白质沉降所需离心力场不同，故可用超速离心法分离蛋白质及测定其分子量，因其结果准确又不使蛋白质变性，故是目前分离生物高分子常用的方法。 沉降系数（S）是指单位离心场强度溶质的沉降速度。S也常用于近似地描述生物大分子的大小。蛋白质溶液经高速离心分离时，由于比重关系，蛋白质分子趋于下沉，沉降速度与蛋白质颗粒大小成正比，应用光学方法观察离心过程中蛋白质颗粒的沉降行为，可判断出蛋白质的沉降速度。根据沉降速度可求出沉降系数，将S带入公式，即可计算出蛋白质的分子质量。 因为沉降系数S大体上和分子量成正比关系，故可应用超速离心法测定蛋白质分子量，但对分子形状的高度不对称的大多数纤维状蛋白质不适用。 s=v/ω2r。s是沉降系数，ω是离心转子的角速度（弧度/秒），r是到旋转中心的距离，v是沉降速度。 沉降系数对于生物大分子来说，多数在(1~500)×10^-13秒之间。为应用方便起见，人们规定1×10^-13秒为一个单位（或称1S）。一般单纯的蛋白质在1~20S之间，较大核酸分 子在4~100S之间，更大的亚细胞结构在30～500S之间。 * 根据转速分类：常用离心机 10 000 rpm 高速离心机 20 000~25 000 rpm 超速离心机 50 000 rpm 相对离心力(×g)= 1.119 × 10–5 ×(rpm)2 × r [g: gravity, rpm: revolution per minut, r: 离心半径] 根据应用分类：分析型离心机 制备型离心机 * 高浓度中性盐可使蛋白质分子脱水并中和其所带电荷，从而降低蛋白质的溶解度并沉淀（结晶）析出，即盐析。但这种作用并不引起蛋白质的变性。这个性质可用于蛋白质的分离。 盐析：指的是一类亲液胶体如：蛋白质胶体、淀粉胶体，以及肥皂水、合成洗涤剂的溶液等，当加入某些无机盐时，使分散质的溶解度降低而结晶析出的过程。盐析过程是可逆的，加水后，分散质又可溶解形成溶液。 在蛋白质溶液中加入大量的中性盐以破坏蛋白质的胶体稳定性而使其析出，这种方法称为盐析。常用的中性盐有硫酸铵、硫酸钠、氯化钠等。各种蛋白质盐析时所需的盐浓度及pH不同，故可用于对混和蛋白质组分的分离。例如用半饱和的硫酸铵来沉淀出血清中的球蛋白，当硫酸铵浓度达到饱和时可以使血清中的白蛋白随之析出，所以盐析法可将蛋白质初步分离。盐析沉淀的蛋白质，经透析除盐，仍保持蛋白质的活性。调节蛋白质溶液的pH至等电点后，再用盐析法则蛋白质沉淀的效果更好。 * 高浓度中性盐可使蛋白质分子脱水并中和其所带电荷，从而降低蛋白质的溶解度并沉淀（结晶）析出，即盐析。但这种作用并不引起蛋白质的变性。这个性质可用于蛋白质的分离。 盐析：指的是一类亲液胶体如：蛋白质胶体、淀粉胶体，以及肥皂水、合成洗涤剂的溶液等，当加入某些无机盐时，使分散质的溶解度降低而结晶析出的过程。盐析过程是可逆的，加水后，分散质又可溶解形成溶液。 在蛋白质溶液中加入大量的中性盐以破坏蛋白质的胶体稳定性而使其析出，这种方法称为盐析。常用的中性盐有硫酸铵、硫酸钠、氯化钠等。各种蛋白质盐析时所需的盐浓度及pH不同，故可用于对混和蛋白质组分的分离。例如用半饱和的硫酸铵来沉淀出血清中的球蛋白，当硫酸铵浓度达到饱和时可以使血清中的白蛋白随之析出，所以盐析法可将蛋白质初步分离。盐析沉淀的蛋白质，经透析除盐，仍保持蛋白质的活性。调节蛋白质溶液的pH至等电点后，再用盐析法则蛋白质沉淀的效果更好。 蛋白质分子表面区域聚集了许多水分子，盐浓度高时，这些水分子被盐抽出，暴露出的疏水区域相互结合，沉淀。 * 沉淀蛋白质的原理：破坏亲水胶体的两个稳定因素 丙酮、乙醇、甲醇等亲水溶剂能与水以任意比例混合，有脱水作用。 可与水混合的有机溶剂，如酒精、甲醇、丙酮等，对水的亲和力很大，能破坏蛋白质颗粒的水化膜，在等电点时使蛋白质沉淀。在常温下，有机溶剂沉淀蛋白质往往引起变性，故应低温快速分离 。但若在低温条件下，则变性进行较缓慢，可用于分离制备