蛋白序列测定—培训课件.ppt

今有一个七肽，经分析它的氨基酸组成是Lys，Pro, Arg, Phe, Ala,Tyr和Ser，该肽未经糜蛋白酶处理时，与DNFB反应不产生α-DNP-氨基酸，经糜蛋白酶作用后，此肽断裂成两肽段。其氨基酸组成分别是Ala, Ser, Tyr和Lys，Pro, Arg, Phe。这两个肽段分别与DNFB反应可分别生成DNP-Ser和DNP-Lys。此肽与胰蛋白酶反应，同样能生成两个肽段，它们的氨基酸组成分别是Arg, Pro和Phe, Tyr, Lys, Ser, Ala。试问此七肽的一级结构序列是怎样？ (五)肽段的氨基酸测序 Edman化学降解法：用Edman试剂PITC与游离氨基作用生成PTH- 氨基酸，并可用各种层析技术分离；现改用蛋白质测序仪。 酶解法：利用氨肽酶和羧肽酶，局限性大，有困难 质谱法：质谱仪 由核苷酸序列推定法：mRNA，cDNA，推出 cDNA的核苷酸序列，然后推测出蛋白质的氨基酸序列 (六) 肽段在多肽链中次序的决定 (七)二硫键位置的确定： 对角线电流法： 一般采用胃蛋白酶水解原来的含二硫键的蛋白质。一是胃蛋白酶专一低，切点多，得到含有二硫键的肽段较小，易分离鉴定；二是在酸性条件下，有利于防止二硫键发生交换反应。 对角线电泳过程 ：把水解后的混合肽段点到滤纸的中央，在pH6.5条件下进行第一向电泳，肽段将按大小及电荷不同分离开，然后 把滤纸暴露在过甲酸蒸气中，使S-S氧化成一对含磺酸基丙氨酸的肽。滤纸旋转90度，在与第一向完全相同的条件下进行第二向电泳。这时大多数氨基酸的迁移率未变，将位于滤纸的一条对角线上，而含磺基丙氨酸的成对肽段将比原来含二硫键的肽小而负电荷增加，结果它们都偏离了对角线。 问题： 有一个A肽，经酸水解分析得知由Lys、Asp、Glu、Arg、Ala、Val 和Tyr组成 。当A肽与DNFB反应后，得DNP-Glu，当用羧肽酶处理后得游离Asp。如果我们在实验中将A肽用胰蛋白酶降解时，得到三个肽，其中一种(Arg、Gln、Tyr),在pH6.4时净电荷为+1，另一种(Ala、Lys) 第三种为（Val和Asn）在pH6.4时，带电荷为零。此外，A肽用糜蛋白酶降解时，也得以两种肽，一种(Gln、Tyr、)在pH6.4时不带电荷，另一种(Arg、Ala、 Val、 Lys 、 Asn)在pH6.4时带2个正电荷 ，问A肽的序列如何？详细写出推理过程。 作业： 1 名词解释 蛋白质的一级结构(protein primary structure）、肽和肽键 2 裂解多肽链的部分方法有哪些，各有何特点？ 第三节　蛋白质的一级结构 蛋白质的相关概念 肽的命名、书写及特点 测序过程 一、相关概念 1.蛋白质的一级结构（Primary structure）:又称为共价结构或化学结构。它是指蛋白质中的氨基酸（残基）的种类、排列顺序及连接方式。 特点： ①具有部分双键的性质,不可以旋转 ②肽键比一般的碳-氧键短； ③与肽键相连的氢原子和氮原子呈反式； 2.肽键(peptide bond) 　 一个氨基酸的α-羧基与另一个氨基酸的α-氨基缩水形成的酰胺键（共价）键，称为肽键。 3.肽(peptide) 　一个氨基酸的羧基与另一个氨基酸的氨基缩水形成的化合物，称为肽。在蛋白质分子中，氨基酸借肽键连接起来，形成肽链。 肽和肽键的形成 肽单位 肽键 肽平面 4.残基(residue) 肽链分子中的每一个氨基酸，由于相互连接而失去一分子水，与原来的结构相比，分子稍有残缺，因此通常把肽链分子中的每一个氨基酸单位称为氨基酸残基(128/110). 二、 肽的命名及书写 1.命名： 　习惯：按数量的多少、按来源 　系统：某氨基酰某氨基酰……某氨基酸 2.书写：从N(H)到C (OH) ，具方向性 　三字母符号或单字母符号表示，中间用“·”或“-”表示。例如:Gly-Glu-Lys-Ala (甘氨基酰谷氨基酰赖氨基酰丙氨酸) 当两个氨基酸通过肽键相互连接形成二肽，在N端仍然有游离的氨基和C端有游离的羧基，每一端连接更多的氨基酸。氨基酸能以肽键相互连接形成长的、不带支链的寡肽和多肽。 多肽仍然有游离的α-氨基和α-羧基。 少于10AA称为寡肽，多于10AA称为多肽或聚肽。 分子量大于10000d称为蛋白质，小于10000d称为多肽。 在生物体中，多肽最重要的存在形式是作为蛋白质的亚单位。 但是，也有许多分子量比较小的多肽以游离状态存在。这类多肽通常都具有特殊的生理功能，常称为活性肽。 实例：谷胱甘肽(glutathione,GSH)