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5、超速离心 * 超速离心法(ultracentrifugation)：根据蛋白质的分子量与形状分离。 *蛋白质在离心场中的行为用沉降系数(sedimentation coefficient, S)表示,沉降系数与蛋白质的密度和形状相关 。 因为沉降系数S大体上和分子量成正比关系，故可应用超速离心法测定蛋白质分子量，但对分子形状的高度不对称的大多数纤维状蛋白质不适用。 1、透析、超滤 根据性质：分子大小 2、盐析（salting out） 根据性质：蛋白质的沉淀 作用机理：中性盐中和表面电荷，破坏水化层 影响因素：表面电荷、水化层、溶剂性质 小结 3、电泳： 根据性质：蛋白质的两性解离 作用机理：异性电荷互相吸引 影响因素：电荷种类及数量、分子大小及形状、溶液离子强度及pH等 4、层析 （1）离子交换层析：电荷、分子量、分子形状 （2）亲和层析：生物特性 （3）吸附层析：吸附特性 （4）分子筛（凝胶过滤层析）：分子大小及形状 大分子先洗脱下来 5、超速离心：分子大小及形状、溶液特性 第六节 蛋白质的结构分析 多肽链中氨基酸序列分析 分析已纯化蛋白质的氨基酸残基组成 测定多肽链的氨基末端与羧基末端为何种氨基酸残基 把肽链水解成片段，分别进行分析 测定各肽段的氨基酸排列顺序，一般采用Edman降解法 一般需用数种水解法，并分析出各肽段中的氨基酸顺序，然后经过组合排列对比，最终得出完整肽链中氨基酸顺序的结果。 通过核酸来推演蛋白质中的氨基酸序列 按照三联密码的原则推演出氨基酸的序列 分离编码蛋白质的基因 测定DNA序列 排列出mRNA序列 蛋白质空间结构测定 * 二级结构测定 通常采用圆二色光谱(circular dichroism，CD)测定溶液状态下的蛋白质二级结构含量。 ?-螺旋的CD峰有222nm处的负峰、208nm处的负峰和198 nm处的正峰三个成分；而?-折叠的CD谱不很固定。 * 三级结构测定 X射线衍射法(X-ray diffraction)和核磁共振技术(nuclear magnetic resonance, NMR)是研究蛋白质三维空间结构最准确的方法。 * 用分子力学、分子动力学的方法，根据物理化学的基本原理，从理论上计算蛋白质分子的空间结构。 根据蛋白质的氨基酸序列预测其三维空间结构 * 通过对已知空间结构的蛋白质进行分析，找出一级结构与空间结构的关系，总结出规律，用于新的蛋白质空间结构的预测。 重要内容： 1、重要名词：isoelectric point；motifs；domain; subunit；allosteric effect; protein denaturation; molecular disease 2、结构层次 元素组成：C、H、O、N（16%）、S 结构单位：20种L-α氨基酸（芳香族、含硫、酸性、碱性氨基酸等） 一级结构：肽键；多肽链；N端?C端 二级结构：稳定力（氢键）；类型（?螺旋，?折叠，?转角，无规卷曲） 三级结构特点 四级结构特点 3、重要性质：两性解离及带电状态判定；紫外吸收；沉淀；变性 4、分离纯化：超滤；盐析；电泳；亲和层析；离子交换层析；分子筛 5、结构与功能关系（举例） Polymerization of HbS O2 血红素与氧结合后，铁原子半径变小，就能进入卟啉环的小孔中，继而引起肽链位置的变动。 正常情况下，糖酵解和三羧酸循环相互协调，即TCA需要多少乙酰CoA, 糖酵解途径就氧化相应数量的葡萄糖生成丙酮酸，进而氧化脱羧为乙酰CoA。酵解速度与三羧酸循环速度的配合不仅有赖于ATP和NADH的抑制作用，而且也受柠檬酸的调控。柠檬酸是酵解途径中磷酸果糖激酶1的重要别构抑制物。 * 氨基酸中与羧基直接相连的碳原子上有个氨基，这个碳原子上连的集团或原子都不一样，称手性碳原子，当一束偏振光通过它们时，光的偏振方向将被旋转，根据旋转的方向分为左旋和右旋即D系和L系，如D-丙氨酸是右旋的和L-丙氨酸是左旋的。而构成天然蛋白质的氨基酸都是L系。注意，一般称D型、L型。 * ？书上为 甘 丙 缬 亮 异亮 脯 书上蛋氨酸为极性中性氨基酸？ 关于甘氨酸： 贾老师主编三版教材为不带电荷的极性R基氨基酸 里包含甘氨酸， 而查老师主编的7版教材为非极性脂肪族氨基酸 * C-N 肽键键长为0.132nm, 介于C-N单键长0.149nm 和双键长0.127nm之间，因此具有一定程度双键性能，不能自由旋转。 * * Β亚基第6位突变 * * 2、一级结构并非影响空间结构的唯一因素 分子伴娘(molecular chaperons，分子伴侣)：在蛋白质加工、折叠形成特定空间构象及穿膜进入细胞器的转位过程中起关键作用的一类蛋白质。 与未折叠的肽段（疏水部分）进行可逆的结