血样DNA的提取—培训课件.ppt

实验总结 通过上网查询实验原理以及董洁老师、杨帆、杨曦师兄、艺馨、李扬师姐等的指导，对如何从血样中提取高质量的全基因组DNA有了一个较清楚的认识。 下一步实验计划 为了进一步加深对原理的理解，以及提高提DNA的实验操作技能，计划在董洁老师的指导下，独立完成整个实验操作,并且针对前几次操作过程中不规范的地方加以改正。 谢 谢! 实验目的 学习高质量血样DNA的提取，理解DNA提取操作原理，在提取过程中学习离心机、Vortex等的使用 实验原理 应用物理、化学等方法从病人血样中提取较纯的全基因组DNA 静置后的血液 血液主要成分 血液 血细胞 血浆 红细胞 白细胞 血小板 血浆蛋白 水 其他物质 无机盐、葡萄糖、氨基酸 血细胞种类 红细胞 白细胞 血小板 数量 特征 最多 最少 1．成熟红细胞无核，两面凹的圆饼状。 功能 2．含血红蛋白，红色。 1．体积比红细 胞大。 2．有核，种类 繁多。 1．体积最小， 无核。 血细胞特征比较 适中 促进止血，加速凝血 防御保护 运输氧气和部分二氧化碳 血浆主要成分 结论 血样各种成分中，只有白细胞含有DNA。 物理方法 离心机（型号：S×4250） : 沉淀 Vortex-5：混匀 化学试剂 溶血液: 9ml 作用：溶解红细胞、白细胞、血小板 白细胞核悬浮液：2ml 作用：使白细胞核充分悬浮（悬浮主要靠物理方 法：vortex） 白细胞核裂解液：2ml 作用：裂解白细胞核，使DNA释放 化学试剂 蛋白沉淀液：1.33ml 作用：使Pr变性沉淀 异丙醇：4ml 作用：洗涤并沉淀DNA 70%乙醇：3ml 作用：洗去较难挥发的异丙醇、盐离 子等 实验操作 血样→ 加溶血液 → 离心 → 加核悬浮液→ 加核裂解液（立即震荡可过夜）→ 加蛋白沉淀液（立即震荡20s) → 离心→ 留上清，加入异丙醇→ 离心→ 留沉淀，加70%乙醇→ 加TE→ 测OD 实验操作 步骤一： 血样 溶血液 细胞碎片、白细胞核 溶血液：( NH4Cl：155mM , NaHCO3 ：10mM , EDTANa2：1.0mM ) 注意事项 能否提到高质量的DNA，好的血样是首要前提，故采集的血样应置于冰箱保存，并尽早进行DNA提取； 做好标记：15ml离心管、1.5ml EP管均需首先进行标号； 移液管使用前必须消毒，减少污染； 移液管顶部要塞上棉花，防止反应液吸入 移液枪内； 注意事项 从冰箱中取出血样时，要小心、不宜晃动，否则容易导致弃去血浆时，损失白细胞； 补加溶血液时，应加至离心管12ml，即加入的溶血液体积应是原血样的3倍左右； 溶血5min后，在灯下看管内有无血块→If 有，可进行二次溶血； 实验操作 离心机：4000 rpm 5min 4℃ ，使白细胞核 沉淀，弃去细胞碎片等大部分杂质 步骤二： 细胞碎片、白细胞核 离心 沉淀：白细胞核、少量杂质（血红素、RNA、蛋白） 注意事项 离心前注意配平，一则保护离心机，二则使离心效果更佳→ If 沉淀不紧密，可置于冰上5min,再离心一次。 离心后，沉淀是白细胞核团， 离心管倒扣于吸水纸的时间不宜太长，也不宜反复倒残余液，否则易导致白细胞核团损失。 血红素 注：血红素可通过其卟啉环与Taq酶的不可逆 结合而抑制 Taq酶活性，对DNA的后续 应用造成影响，必须尽量除尽 血红素的除去 血红素溶于水，所以可以在洗涤过程中被除去， 当离心后的细胞核基本不带红色，说明血红素基本已除尽 RNA 由于RNA基本上存在于细胞质中，因而细胞膜破裂后，存在于上层液体中，离心后大多数已经除去。 实验操作 步骤三： 沉淀：（白细胞核、少量杂质） 细胞核悬浮于溶液中 白细胞核悬浮液 悬浮液：( Tris-HCl：50mM、PH=8.0 , NaCl：150mM （=生理盐水：0.9%?）, EDTANa2：20mM ) 白细胞核的悬浮主要是vortex的功劳，因而要立即并充分 vortex 实验操作 步骤四： 细胞核悬浮液 细胞核裂解液 DNA、大量蛋白、RNA、盐类 微量血红素 核裂解液： ( Tris-HCl , NaCl , EDTANa2（以上各溶度