培训课件：酶联免疫吸附试验(ELISA)操作注意事项概要.ppt

7 比色 ELISA的比色测定由酶标仪进行。此处强调以下几点： （1）酶标仪不应安置在阳光或强光照射下，室温宜在15－30℃，使用前先预热仪器15－30分钟，测读结果更稳定。各种酶标仪性能不同，使用前应详细阅读说明书。 （2）比色前应先用洁净的吸水纸拭干板底附着的液体，然后将板正确放入比色架中，以免锈蚀酶标仪比色架。 （3）比色测定时，一定要注意酶标仪的波长是否已调至合适或所用滤光片是否正确。 （4）单波长或双波长比色选择的问题。 所谓的单波长比色即是通常的以对显色具有最大吸收的波长如450nm或492nm进行比色测定； 而双波长比色则在敏感波长如450nm和非敏感波长如630nm下各测定一次，最后酶标仪给出的数值为敏感波长下的吸光度值与非敏感波长下的吸光度值的差值。 因此，双波长比色测定具有能排除由微孔板本身、板孔内标本的非特异性吸收、指纹、刮痕、灰尘等对特异显色干扰的优点。 8 结果判断 ELISA测定按其表示测定结果的方式分为定性和定量测定两大类。 定性测定只是对样品中是否含有待测抗原或抗体作出“有”或“无”的结论，分别用“阳性”和“阴性”来表示；定量测定，每批测试均须用一系列不同浓度的标准品在相同的条件下制作标准曲线。 产生非特异性显色的原因 试剂盒因素：固相载体原料的不同和制作工艺的差别、包被物的提纯度、固相载体表面未被包被的空隙封闭不良等； 人为因素：加样、洗板、温育、判断结果中的操作不当或责任心不强等造成假阳性或假阴性； 标本中含有干扰物： 1.内源性干扰物——样品中有与目标成分性质相似的物质。 2.外源性干扰物——常常因样品采集、储存、处理不当造成的样品性质变异，被细菌污染等。 ELISA实际操作中常见的问题和解决办法 谢 谢 * * AP 磷酸酯酶 酶联免疫吸附试验操作 注意事项 酶免疫测定类型 这种固相酶免疫测定方法在1971年最初建立时称为酶联免疫吸附剂测定（Enzyme Linked ImmunoSorbent Assay），简称ELISA。 酶免疫技术 酶免疫组化 酶免疫测定 均相酶免疫测定 非均相酶免疫测定 固相酶免疫测定 液相酶免疫测定 ELISA原理（以一步法双抗体夹心法测抗原为例） ELISA其原理为抗原抗体特异性结合和抗原抗体的酶标记，以酶催化底物显色来判断结果。 影响酶联免疫测定的因素较多, 诸如标本的采集保存、试剂的准备、加样的技术、孵育温度的控制、洗涤反应板的方式、显色反应时间的控制等一系列问题均有可能对试验结果产生很大的影响, 只有避免了这些因素, 才能保证试验结果的准确性和可靠性。 1. 样品准备 （1） 吸样之前要保证移液枪、枪头和液体处于相同温度。置于冰箱保存的样品应提前取出，室温放置，使温度平衡后再吸样。 液体温度 吸头温度的 移取的液体体积会 偏大 液体温度 吸头温度的 移取的液体体积会 偏小 （2） 若溶剂瓶中液体太少，可倒入EP管中，方便吸取。 2. 体积设定 大体积 ? 小体积 逆时针 精度最佳 小体积 ? 大体积 顺时针 调至超过设定刻度，再回调 可保证最佳的精确度 严格的精确调节方法 3. 装枪头 将移液枪端垂直插入吸头，左右微微转动，上紧即可 上下敲击会引起内部的零部件因瞬间强烈撞击而松散， 甚至会导致调节刻度的旋钮卡住 4. 吸液 （1） 垂直吸液，枪头吸嘴尖端需浸入液面2-4mm以下。 （2） 枪头吸嘴预润湿（2-3次），使吸嘴内壁液体吸附达到饱和，再吸入样液，最后打出液体的体积会很精确。 一般液体，正向吸液（一档?二档）。 粘稠液体和易挥发液体，可反相吸液（二档?一档）。 正向吸液 反向吸液 （3） 缓慢吸取，控制好弹簧的伸缩速度。吸液速度太快会产生反冲和气泡，导致移液体积不准确和腐蚀枪体。 （4） 吸取后将移液枪提离液面，停约一秒钟，观察是否有液滴缓慢地流出。若有流出，说明有漏气现象（原因有：枪头未上紧；枪头不匹配；移液枪内部气密性不好）。 （5） 吸嘴外壁残留液滴可沿壁靠去或用滤纸蘸擦。 5. 放液 （1） 将吸嘴口贴到容器内壁并保持10-40°倾斜。 （2） 平稳地把按钮压到一档，停约一秒钟?二档，排出剩余液体。排放致密或粘稠液体时，压到一档后，再多等一两秒钟?二档。 （3） 压住按钮，同时提起移液器，使吸嘴贴容器壁擦过。 （4） 松开按钮。 （5） 按弹射器除去移液嘴。 （6） 使用完毕。 移液枪的养护及注意事项 吸取液体时一定要缓慢平稳地松开拇指，绝不允许突然松开，以防溶液吸入过快而冲入枪体内腐蚀柱塞造成漏气。 移液