巢式PCR快速检测西瓜细菌性果斑病菌_5.doc

巢式PCR快速检测西瓜细菌性果斑病菌 中国农业科学 ２ ０ １ ４ ， ４ ７ （ ２ ） ： ２ ８ ４ — ２ ９ １ 　 Ｓ ｃ ｉ ｅ ｎ ｔ ｉ ａ 　 Ａｇ ｒ ｉ ｃ ｕ ｌ ｔ ｕ ｒ ａ 　 Ｓ ｉ ｎ ｉ ｃ ａ 　 ｄ ｏ ｉ ： １ ０ ． ３ ８ ６ ４ ￣ ． ｉ ｓ ｓ ｎ ． ０ ５ ７ ８ — １ ７ ５ ２ ． ２ ０ １ ４ ． ０ ２ ． ０ ０ ８ 　 巢式 Ｐ Ｃ Ｒ快速检 测西瓜细 菌性果斑病 菌　 王 婧，毕 阳，朱 艳 ，韩舜愈 ，祝 霞，盛文军，李 敏　 （ 甘 肃 农业大 学食 品科 学 与工程 学 院 ，兰 州 ７ ３ ０ ０ ７ ０ ） 　 摘要 ： 【 目的】 建立 ｎ ｅ ｓ ｔ ｅ ｄ — Ｐ Ｃ Ｒ 方法 ， 快速检 测西瓜种子 中的燕麦嗜酸菌西瓜亚种 （ Ａ ｃ ｉ ｄ ｏ ｖ ｏ ｒ ａ ｘ ８ Ｖ ｅ ｌ ｌ ａ ｏ 　 ｓ ｕ ｂ ｓ ｐ ． 　 ｃ ｉ ｔ ｒ ｕ ｌ ｌ ｉ ，Ａ ａ ｃ ） ，为西瓜 细菌性果斑病 （ ｂ ａ ｃ ｔ ｅ ｒ ｉ ａ ｌ 　 ｆ ｒ ｕ ｉ ｔ 　 ｂ ｌ ｏ ｔ ｃ ｈ 　 ｏ ｆ 　 ｗ ａ ｔ ｅ ｒ ｍ ｅ ｌ ｏ ｎ ，Ｗ Ｆ Ｂ ）的防控提供技术支持 。 　 【 方法】 根据 Ａ ａ ｃ Ｂ Ｏ Ｘ 短重复序列的 Ｐ Ｃ Ｒ 产物设计两对 引物 Ｂ Ｘ － Ｌ １ ／ Ｂ Ｘ － Ｒ ５ 和Ｂ Ｘ － Ｌ １ ／ Ｂ Ｘ — Ｓ － Ｒ ２ ， 建 立以 Ｂ ｘ — Ｌ １ ／ Ｂ Ｘ — Ｒ ５ 　 为外侧 引物，Ｂ ｘ — Ｌ １ ／ Ｂ Ｘ — ｓ — Ｒ ２ 为 内侧 ５ 『 物的ｎ ｅ ｓ ｔ ｅ ｄ － Ｐ ｅ Ｒ ，以 ５ 　 ｕ Ｌ 样 品处理 液于 ９ ９ 高温裂解 １ 　 ０ 　 ｍ ｉ ｎ ，再放置冰　 上冷却 ５ 　 ｍ ｉ ｎ ，以所释 放病原 Ｄ １ ４ Ａ 为模板进行 Ｐ Ｃ Ｒ扩增 ，采用 ５ ０ 　 Ｉ ． ｔ Ｌ 反应体系：５ 　 Ｌ 　 １ 　 ０ × Ｐ Ｃ Ｒ 　 ｂ ｕ ｆ ｆ ｅ ｒ （ ２ ５ 　 ｍ ｍ ｏ １ ． Ｌ 　 Ｍ ｇ Ｃ １ 　 ２ ） ，４ 　Ｌ 　 ｄ Ｎ Ｔ Ｐ （ Ｄ ４ ０ ３ ０ Ｒ Ａ ，２ ． ５ 　 ｍ ｍ ｏ １ Ｌ 　） ，５ 　 Ｊ 物 （ ５ 　 ｇ ｍ ｏ １ Ｌ 　）各 ３ 　 Ｌ ，０ ． ４ 　 Ｌ 　 Ｔ ａ ｑ 　 Ｄ Ｎ Ａ酶 （ Ｄ Ｒ ０ ０ １ Ｂ ，５ 　 Ｕ 　 Ｌ 　） ，通过退火温度优化 ， 反 应条件 为：引物 Ｂ Ｘ － Ｌ １ ／ Ｂ Ｘ － Ｒ ５ 各３ 　 Ｌ进行 第一轮扩增 ，９ ５ ，２ 　 ｍ ｉ ｎ ；９ ５ ，３ ０ 　 ｓ ； 　 ６ ５ ，４ ５ 　 ｓ ；７ ２ ，１ 　 ａ ｒ ｉ ｎ ；３ ５ 个循环；７ ２ ，延伸 ７ 　 ａ ｒ ｉ ｎ ；取扩增后 的产物 １ 　 ｇ Ｌ 为模板 ， 以引物 Ｂ Ｘ － Ｌ １ ／ Ｂ Ｘ — ｓ — Ｒ ２ 　 各３ 　 ｐ Ｌ 进行第 二轮扩增 ，９ ５ ，２ 　 ｍ ｉ ｎ ；９ ５ ，３ ０ 　 ｓ ，６ ６ ，４ ５ 　 ｓ ，７ ２ ，１ 　 ｍ ｉ ｎ ，３ ０ 个循环，７ ２ ，７ 　 ｍ ｉ ｎ 。在 　 此条件 下对梯度 Ａ ａ ｃ 菌悬液、模 拟带菌种 子提取液进行特异性 、灵敏性及 重复性检验 ，对不 同带菌率 的西瓜种子　 提取液进 行检 测。 【 结果 】Ｂ 『 物Ｂ ｘ — Ｌ １ ／ Ｂ Ｘ － Ｒ ５ 和Ｂ Ｘ － Ｌ １ ／ Ｂ Ｘ － Ｓ － Ｒ ２ 在检测不 同来源 的 Ａ ａ ｃ 菌株 时都产 生了预期大小 　 的片段， 并且对其近源种燕麦嗜酸菌卡特菜兰亚种（ Ａ ． 　Ｖ ｅ Ｈ ７ ￣ ０ 　 ｓ ｕ ｂ ｓ ｐ ． ｃ ８ ｔ ｔ ｌ ｅ ｙ ａ ｅ ） 、 魔芋假单胞菌（ Ａ ． ａ ｖ ｏ Ｈ ａ ｅ 　 ｓ ｕ ｂ ｓ Ｐ 　 ｋ ｏ ｎ ｊ ａ ｃ ｉ ）及 其不 相 关菌株 未 扩增 出 目标 片段 。 以 Ｂ ｘ — Ｌ １ ／ Ｂ Ｘ － Ｒ ５为 外侧 ５ 】 物 ，Ｂ Ｘ － Ｌ １ ／ Ｂ Ｘ － Ｓ － Ｒ ２ 为 内侧 引物 的 　 ｎ ｅ ｓ ｔ ｅ ｄ － Ｐ ｅ Ｒ ， 对Ａ ａ ｃ 纯菌液和模拟带菌种子提取液的最低检测 限 ４ ． ７ × １ 　 ０ 　 ｃ ｆ ｕ ／ ｍ Ｌ ， 比ｄ ｉ 　 ｒ ｅ ｃ ｔ － Ｐ Ｃ Ｒ 灵敏度 高出 １ 　 ０ ０ ０ 　 倍。 当西瓜种子 带菌率在 ０ ． １ ％ 一０ ． ５ ％ 时， ｎ ｅ ｓ ｔ ｅ ｄ － Ｐ Ｃ Ｒ阳性检测率为 ６ ６ ． ７ ％ ； 当种子带菌率