感染性克隆的发展及应用—培训课件.ppt

开发载体疫苗 Sindbis SFV Kunjin NDV CSFV * * * * * * 研究方案 PRV鄂A株 含全长PRV基因组感染性的BAC载体（pPEa）的构建 通过直接连接克隆基因 的pPEal载体的构建 接合介导的通用 整合克隆系统的构建 利用同源重组的通用 整合克隆系统的构建 PI-PspI I-SceI 插入pPEa的某一位点 EcoRI PacI 插入pPEa的某一位点 供体 质粒 受体 质粒 受体 菌株 质粒的构建 宿主菌株的改造 利用这三套系统分别克隆本实验室有的病原微生物的免疫原性基因6~8个，检测其有效性 将这三种方法组合，构建能表达多个基因的载体，并对载体扩容 表达研究 多价苗 基因剂量效应 拟病毒 最终目标： 将PrV的感染性克隆改造成可以随意、高通量插入的载体系统，使重组病毒的构建更快速、更便捷。 RNA病毒感染性克隆 1978年，Taniguchi首次发现将包含RNA噬菌体Qβ基因组全长 cDNA的质粒导入细菌后具有感染性——感染性克隆（Nature, 1978) 1981年，Racaniello等通过脊髓灰质炎病毒全长cDNA获得了动物病毒的感染性克隆，实现了正链RNA病毒的感染性克隆(Science, 1981) 1989年，Luytjes等建立了流感病毒的感染性克隆操作系统，开创了分节段的负链RNA病毒感染性克隆的研究（Cell, 1989) 1994年,Schnell等构建并获得了狂犬病毒的感染性克隆，建立了不分节段的负链RNA病毒感染性克隆体系。 正链RNA病毒感染性克隆 在不同的启动子下， 利用RNA聚合酶进行体外转录 用转录物转染易感 细胞直接注入感染动物 （体内） 病毒的RNA提取 长链RT-PCR （LA—RT-PCR） 分段克隆 病毒基因组 各个cDNA片段 拼连成全长cDNA 连入低拷贝的原核载体（启动子） 或真核表达载体 转染易感 细胞或直 接注入感 染动物 （体内） 病毒粒子 获救 正链RNA病毒感染性克隆的构建流程图 CSFV CWH/2003株全长基因组cDNA分子构建策略 正链RNA病毒感染性克隆的构建策略 体外转录（T7/SP6/SP3) 体内转录（CMV) 已构建感染性克隆的正链RNA病毒 猪瘟病毒（Ruggli et al,1996） 口蹄疫病毒（Leippert et al,1997) 牛病毒性腹泻（Vassilev et al,1997) 马动脉炎病毒（Van Dinten et al,1997) 日本乙型脑炎（Gritsum et al,1998) 蓝耳病病毒（Meulenberg et al,1998） 猫杯状病毒（Thumfart et al,2002) 影响正链RNA病毒感染性克隆构建获得的因素 扩增、克隆、转录和增殖过程的突变 病毒序列在大肠杆菌中的不稳定性 RNA转录产物的异质性 病毒特殊结构的影响（基因组5’ 末端、poly(A)、帽子结构） 突变的影响 RT-PCR过程中的突变 全长cDNA克隆在大肠杆菌增殖过程中的突变 转录过程中的突变 在被转染和动物体内的突变 有些全长转录本比亲本病毒RNA更容易产生细胞病变——有利于感染的突变？ 全长cDNA克隆在大肠杆菌中的不稳定性 黄热病毒和日本乙型脑炎全长cDNA克隆难以获得感染性 病毒的某些序列在细菌中不稳定 对细菌有潜在的毒性 解决方案： 用体外连接的全长cDNA进行转录 更换菌株或克隆载体 改变培养温度 插入嵌合内含子序列（Vladimir,2001) RNA转录本的异质性 病毒基因组在体内、体外转录时容易提前终止 利用噬菌体RNA聚合酶获得的体外转录本通常只有30%是基因组长度的 大量不完整的、不可复制的分子会干扰病毒的拯救 病毒特殊结构的影响 基因组5’ 末端碱基冗余或缺失 基因组3’ 末端碱基冗余（非病毒核酸） poly(A)的长度 帽子结构 负链RNA病毒感染性克隆 已成功构建感染性克隆的负链RNA病毒 核糖核蛋白复合体（RNPs） 对于负链RNA病毒从cDNA克隆拯救感染性病毒的一个重要环节是装配功能性的核糖核蛋白复合物（Ribonucleoprotein (RNP) complex) RNPs由病毒RNA（vRNA)、核蛋白(nucleprotein)以及病毒聚合酶复合体（viral polymerase complex) Influenza A virus 不分节段的负链RNA病毒感染性克隆构建策略 分节段的负链RNA病毒 8-plasmid based system for rapid generation of influenza A viruses 操作体系的建立极大地增加了对RNA病毒进行研究的潜能，尤其便利了对一些感染细胞后增殖滴度低或难以分离的R