木薯醇腈酶cDNA的克隆及其表达载体的构建论文.docVIP

　　木薯醇腈酶cDNA的克隆及其表达载体的构建论文 王丹 何浪 王玉明 潘克俭 李维 【摘要】 目的 克隆木薯醇腈酶（HNL）cDNA构建表达载体，以实现木薯醇腈酶基因的高效表达。方法 运用 RT-PCR从木薯幼叶组织中扩增出HNL全长cDNA序列，将其克隆至质粒pBluescript SK中进行序列分析，再利用PCR将其再克隆到酵母表达质粒pPIC3.5K上。结果 经测序分析表明，克隆的cDNA片段和文献报道的4个木薯HNL cDNA 相比，核苷酸同源性最高为99.1%，氨基酸同源性最高为98.8%。结论 经双酶切鉴定的结果表明重组表达载体的表达载体构建成功。 【关键词】 木薯；醇腈酶；甲醇酵母；表达载体 Abstract：Objective To study the cloning of the cDNA of α-HNL and the expression vector construction to realize highly efficient expression in NL gene.Methods The long-length sequence of cDNA of α-HNL plified by RT-PCR,then it onstrated that the highest homology of cDNA sequence is about 99.1% and the highest homology of amino acid sequence is about 98.8% to those four reported HNL genes from cassava.Conculsion Degestion detection of pPIC3.5K-HNL shoa公司；限制酶、Taq DNA聚合酶，其它抗生素等分别购自华美生物工程公司、Promega等公司；其他化学试剂均为国产分析纯或进口分析纯。 1.1.4 培养基 LB，LA，SOB，SOC培养基均按Invitrogen公司操作手册推荐方法配制。 1.2 方法 1.2.1 基因操作 质粒DNA的制备、限制酶切、连接反应、细菌转化、凝胶电泳、DNA片段的回收等，参照文献［6］或按供应商提供的相关说明操作。 1.2.2 木薯幼叶组织总RNA的提取 取木薯新鲜幼叶，用液氮研磨3～4次，用RNA提取试剂盒提取总RNA。 1.2.3 RT-PCR扩增HNLcDNA 根据Haughes［7］等报道的木薯醇腈酶cDNA序列设计RT-PCR引物，由上海基康生物有限公司合成。其中上游引物设计EcoRⅠ酶切位点，下游引物引入BamHⅠ酶切位点，具体序列如下: 上游引物Hnl-1：5′-cggaattcatggtaactg cacattttg-3′ 下游引物Hnl-2：5′-gtggatcctcaagcatat gcatcagcc-3′ RT-PCR则参照试剂盒说明书按以下方法进行：50℃ 30min合成cDNA第一链后，直接加入试剂盒提供的专一性Taq DNA polymerase进行PCR反应，PCR参数为：94℃预变性3min后，按94℃变性1min，57℃复性1min，72℃延伸1min,进行30个循环，然后于72℃再延伸10min。 1.2.4 DNA序列的测定 用ABI377全自动测序仪测序。 1.2.5 表达载体的构建 用质粒提取试剂盒分别提取约20μg重组质粒和表达质粒pPIC3.5K，分别经EcoRⅠ、BamHⅠ双酶切，并用连接酶连接，转化大肠杆菌JM109感受态细胞，涂布在含有氨苄青霉素的LB平板，培养过夜。 2 结果 2.1 木薯HNLcDNA的克隆及序列测定 从木薯幼叶组织提取总RNA为模板(图1)，按材料和方法中所述条件进行反转录，再进行PCR扩增，用琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物，检测到一条约0.8 kb的DNA片段，正好与预期的扩增片段相符（图2）。 Lane3:18S RNA and 28S RNA RNA of cassava leave 图1 木薯幼叶组织总RNA的电泳 Fig.1 Electrophoresis analysis of RNA of cassava leave RT-PCR产物经BamHⅠ和EcoRⅠ酶切，和经同样酶切处理的pBS 连接，转入E.coli JM109，筛选重组质粒，通过酶切鉴定(图2)，获得阳性克隆，命名为pBS-HNL。对插入的片段进行DNA序列测定(图3)。该cDNA序列实际长度为777个碱基，编码258个氨基酸，与来自木薯的醇腈酶Me-HNL10基因的cDNA序列相比［7］，123，252，373，435，628，660，683位的