杜仲含药血清诱导骨髓间充质干细胞定向分化蛋白质组学研究论文.docVIP

　　杜仲含药血清诱导骨髓间充质干细胞定向分化蛋白质组学研究论文 曾建春 樊粤光 刘建仁 易春智 阎亮 【摘要】 目的研究杜仲含药血清诱导骨髓间充质干细胞 (Mesenchymal stem cells,MSCs) 向成骨细胞定向分化过程的蛋白表达差异，分析杜仲诱导MSCs向成骨细胞分化的可能调控机制。方法对杜仲含药血清干预前、干预后第2天、第7天，第14天的细胞提取总蛋白，通过双向电泳分离、PDQuest-7.3.0胶图分析软件进行分析找出差异蛋白，并进行质谱分析、数据库查询建立功能蛋白质组。结果双向电泳分离得到641个蛋白点，选取其中75个点进行质谱分析，经数据库查询得到6个功能蛋白。结论实验认为补肾中药杜仲可能通过上调波形蛋白、核纤层蛋白A的表达促进细胞分化，下调钙网织蛋白表达.freel containing Duzhong（Cortex Eumiae）, and its possible regulation mechanisms.MethodsTotal protein of cells interfered by blood serum containing Duzhong（Cortex Eumiae）for 0day, 2days, 7days,14days, ensional electrophoresis and searched for different protein spot by PDQuest-7.3.0 softe ass chromatographic analysis and data base querying. Results641 protein spots ass chromatographic analysis, and 6 functional protein iae）may up-regulate express of vimentin and lamin A to promote cell differentiation, doineralization in bodies. SOD and annexin A6 are concerned ate relation MSCs to osteoblast is unknoiae）； MSCs； Proteome； Tensional electrophoresis 骨髓间充质干细胞（MSCs）是一种多功能干细胞，在不同条件下可向成骨细胞、软骨细胞、心肌细胞等分化。中医学认为，肾藏精，主骨，生髓，经前期研究发现，杜仲含药血清能够诱导MSCs向成骨细胞分化并促进细胞增殖，但对于MSCs向成骨细胞分化这一复杂过程的机制缺乏相关研究。 蛋白质组学研究是后基因组学时代又一重要研究工具，已经广泛应用到生命科学各个领域。本文建立补肾中药杜仲含药血清干预 MSCs体外定向分化为成骨细胞过程，采用蛋白组学技术分析MSCs分化过程中不同时间点蛋白表达的变化情况，从蛋白质分子水平上解释杜仲干预 MSCs分化的可能机理。 1 器材 1.1 动物SPF SD大鼠2只，体质量150～200 g，雌雄不限，由广州中医药大学实验动物中心提供。 1.2 试剂L-DMEM培养基、南美洲胎牛血清（FBS、海克隆），杜仲（产地云南），0.25%胰酶（GIBCO公司），矿物油、标准蛋白、CHAPS、DTT、Indoacetamide（sigma），尿素（BBI），硫脲（天津市化学试剂一厂），PH3-10两性电解质（Bio-Rad），考马斯亮蓝 ( G2 250、R2 250 )、低熔点琼脂糖、苯甲基磺酰氟( PMSF)、三羟甲基胺基甲烷(Tris)、N,N-甲叉双丙烯酰胺、甘氨酸、十二烷基磺酸钠 ( SDS)、溴酚蓝、甘油、无水碳酸钠、硫代硫酸钠、 三氟乙酸(TFA)、无水甲醇、无水乙醇、冰醋酸为国产分析纯，购于广州威佳公司。 1.3 器材25，75，175 cm2培养瓶（Coning），酶标仪（Thermo），CO2培养箱 (Heraeus)，注射器针头滤器，0.22 μm滤膜（MILLIpore），SIGMA-3K15离心机（sigma），双向电泳仪器：Multiphor II（Amersham）、Protean II xi cell（Bio-Rad），IPG固相胶条（17cm，PH：3-10，Bio-Rad），PDQuest凝胶分析软件( 7.3.0版本) (美国Bio- Rad公司)、 Poics Analyzer（ABI公司），超低温冰箱（SANYO）。 2 方法 2.1 杜仲含药血清的制备取杜仲药材粗粉150 g，加70%乙醇10倍量，加热回流两次，1 h/次，过滤，合并滤液，滤液减压浓缩至300 ml，室温冷却，4℃冰箱保存备用。