杜氏利什曼原虫amastin基因重组真核表达质粒的构建与表达论文.docVIP

　　杜氏利什曼原虫amastin基因重组真核表达质粒的构建与表达论文 .freelid of amastin gene of Leishmania Donovani Abstract AIM: To construct rebinant eukaryotic expression plasmid of amastin gene of Leishmania Donovani anddetectexpressionofthegeneinNIH3T3cells.METHODS: Amastin gene plified from nuclear DNA of Leishmania Donovani isolates and cloned into an eukaryotic expression vector pcDNA31(+). The rebinant plasmid ed pcDNA31amastin. NIH3T3 cell astin. Transient and stable expression of amastin gene munofluoresence and RTPCR. RESULTS: It embrane and inside the cell. It shoastin successfully. CONCLUSION: A rebinant eukaryotic expression plasmid of amastin gene of Leishmania Donovani ania Donovani; amastin gene; express in vitro 摘 要 目的: 构建杜氏利什曼原虫无鞭毛体蛋白(amastin)编码基因的真核表达重组质粒pcDNA31amastin, 并研究其在NIH3T3细胞中的表达。方法: 提取杜氏利什曼原虫基因组DNA进行PCR扩增。将扩增的无鞭毛体蛋白基因片段导入质粒pcDNA31(+)中, 构建真核表达重组质粒pcDNA31amastin。以pcDNA31amastin转染NIH3T3细胞, 采用免疫荧光染色法和RTPCR分别鉴定pcDNA31amastin的瞬时表达和稳定表达。结果: 在细胞膜和细胞内均观察到较强的绿色荧光, 表明pcDNA31amastin成功地转入NIH3T3细胞,.freelastin)的研究1, 2使其有望成为一种黑热病疫苗的候选分子。本研究根据GenBank中登录的4种利什曼原虫无鞭毛体蛋白编码基因的序列, 自行设计引物, 克隆了杜氏利什曼原虫的无鞭毛体蛋白编码基因, 并将其导入质粒pcDNA31(+)中, 构建了真核表达重组质粒pcDNA31amastin, 并在NIH3T3细胞中获得稳定表达, 为进一步构建黑热病无鞭毛体蛋白基因疫苗奠定了基础。 1 材料和方法 1.1 材料 杜氏利什曼原虫四川省汶川县人分离株(MHOM//90/SC10H2)及NIH3T3细胞均由本室保存。限制性内切酶BamH I和Xho I为Fermentas公司产品。PCR扩增所用聚合酶Premix Ex Taq为宝生物工程（大连）有限公司产品。胶回收试剂盒为Bioer Technology公司产品。质粒小量提取试剂盒为Omega公司产品。T4 DNA连接酶为NeL/L小牛血清的M199培养液中进行扩大培养。当虫体总数达5×109～1×1010时收集虫体, 参照文献3的方法略加修改提取虫体基因组DNA。 1.2.2 PCR引物的设计和合成 根据GenBank中登录的4种利什曼原虫无鞭毛体蛋白编码基因的序列设计一对引物, 在上游引物P1的5′端添加BamH I识别序列和保护序列, 在下游引物P2的5′端添加Xho I识别序列和保护序列。引物的合成由宝生物工程（大连）有限公司完成。引物的序列如下: P1: 5′GGCGGATCCATGCTGTGCTCGTGCATCGTGTT3′（划线处为BamH I酶切位点）; P2: 5′CGCCTCGAGCTACATTATAATCAGCAGCACCAGG3′（划线处为Xho I酶切位点）。 1.2.3 无鞭毛体蛋白基因的扩增 PCR反应条件为94℃预变性3 min, 然后94℃变性30 s, 60℃退火40 s, 72℃延伸40 s, 共30个循环, 最后1个循环后于72℃再延伸10 min。扩增产物经10 g/L琼脂糖凝胶电泳鉴定。 1.2.4 无鞭毛体蛋白基因的克隆 将上述PCR产物、 质粒载体pcDNA31(+)分别以BamH I和Xho I双酶切, 经胶回收试剂盒纯化酶切后的产物, 并用T4 DNA连接酶将无鞭毛体蛋白基因片段与质粒pcDNA31(+)相连接。取连接产物转化预先制备的大肠杆菌DH5α