构建由缺氧反应元件修饰的hTERT核心启动子引导FCY1基因表达的复制缺陷型腺病毒论文.docVIP

　　构建由缺氧反应元件修饰的hTERT核心启动子引导FCY1基因表达的复制缺陷型腺病毒论文 .freelents;transcriptional target-ing;telomerase;adenoviridae;geic vectors Abstract:AIM To construct replication-defective rebi-nant adenovirus ultimer of hypoxia re-sponsive elements-modified hTERT core promoter.METH┐ODS Multimer of hypoxia responsive elements to the hTERT core promoter，then confirmed by sequencing.The modified hTERT promot-er and FCY1ids and cotrans-fected HEK293cells id pBHGlox（delta）E1，3Cre.RESULTS Rebinant adenoviruses ents-modified hTERT core promoter pli-fied.The titers of the resulting adenoviruses ined by end-point dilution assay.CONCLUSION The ade-noviral vector construction kit based on Cre rebinase/loxP system can be easily and efficiently used in construction of replication-defective adenovirus. 0 引言 转录靶向已成为肿瘤基因治疗的热点［1，2］ .使用肿瘤特异性启动子或组织特异性启动子引导治疗基因在肿瘤组织中特异性的表达不仅能有效治疗肿瘤，而且可以在最大程度上减轻基因治疗的毒副作用.目前研究证实，85%以上的人类肿瘤组织中均有端粒酶活性的上调，提示存在端粒酶逆转录酶启动子（hu-man telomerase reverse transcriptase，hTERT）的激活.已有使用该启动子对膀胱癌［3］ 、肝细胞肝癌［3］ 、骨肉瘤［4］ 、胶质瘤［5］ 等恶性肿瘤进行靶向转录基因治疗的报道.为了进一步提高该启动子在骨肉瘤组织中的表达特异性并增强其活性，根据实体瘤组织局部的缺氧微环境特点以及缺氧反应元件可使异源启动子获得在缺氧环境下可被激活的特性［6-9］ ，我们使用Cre重组酶/loxP腺病毒构建系统成功构建了使用缺氧反应元件串联重复序列修饰的hTERT启动子引导酵母胞嘧啶脱氨酶基因FCY1表达的重组腺病毒，为其在实体瘤治疗中的应用奠定了基础. 1 材料和方法 1.1 材料 HEK293细胞系和AdMax Kit D购自Microbix Biosystems Inc.（Canada）.pGL3-181hTERT［10］ 由日本Kanzaega Corporation（USA）.CONCERT High Purity Plasmid Miniprep System，LipofectAMINE等购自Gibco BRL.Opti-CellTM 10mL 100cm-2 培养板购自Bio Crystal公司.50bp DNA Ladder购自MBI Fermentas公司. 1.2 方法 1.2.1 缺氧反应元件串联重复序列的构建 人工设计内含3个小鼠磷酸甘油酸激酶1基因5’端缺氧反应元件（5’-TGT CAC GTC CTG CAC GAC-3’）的S84寡核苷酸序列，其中5’端加入KpnⅠ，XbaⅠ，SalⅠ酶切位点，3’端加入XhoⅠ和MluⅠ酶切位点.同时以S84为模板设计引物，上游引物PP1为5’-GGT ACC TCT AGA GTC-3’，下游引物PP2为5’-ACG CGT CTC GAG TG-3’.S84，PP1，PP2均由上海Sangon公司合成.以S84为模板，PP1，PP2为引物做PCR反应.循环参数为94℃30s，55℃30s，72℃30s，32个循环，最后延伸10min.反应结束后在20g L-1 TAE琼脂糖凝胶电泳上鉴定，用QIAEXⅡGel Extraction Kit回收DNA并插入pGEM-T Easy Vector，转化JM109感受态细胞后进行蓝白筛选.挑取白色菌落，加入含100mg L-1 氨苄青霉素的LB培养基30mL，160r min-1 摇菌，37℃过夜培养后提取质粒，用KpnⅠ和MluⅠ进行双