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　　柴胡疏肝散抗肝纤维化的实验研究论文 付德才 杨世忠 宋祥福 【摘要】 目的 探讨柴胡疏肝散对肝纤维化大鼠模型αSMA、TGFβ1的影响及其抗纤维化的机制。方法 采用40% CCl4皮下注射，制备肝纤维化模型并以柴胡疏肝散干预，测定肝功能、血清透明质酸(HA)、层黏连蛋白(LN)及肝组织羟脯氨酸(HYP)，光镜观察肝组织病理变化，免疫组织化学法检测肝组织αSMA、TGFβ1表达，RTPCR 检测TGFβ1 mRNA 的表达。结果 柴胡疏肝散组较模型组:肝功能明显改善，血清HA及LN显著降低，肝组织HYP含量明显少.freell的浓缩药液冷藏备用。按体表面积折算,大鼠每天的柴胡疏肝散等效剂量为28 g/kg(体重) 。 112 药品及试剂 CCl4购自北京北化精细化学品有限责任公司)；秋水仙碱(colchicine) 购自昆明股份制药有限公司;谷丙转氨酶、谷草转氨酶试剂盒购自上海科欣生物技术研究所；血清总胆红素(TBIL)试剂盒购自上海科华东菱诊断用品有限公司；透明质酸(HA)、层黏连蛋白(LN)放射免疫分析测定盒购自上海海军医学研究所生物技术中心；单克隆急用型鼠抗人生αSMA试剂盒购自北京中杉生物公司，兔抗大鼠TGFβ1多克隆抗体购自武汉博士德生物工程有限公司，即用型SP免疫组化试剂盒购自福州迈新试剂公司，DAB购自北京中山生物公司，RTPCR两步法试剂盒购自TAKARA公司，Trizol购自Sangon公司。 12 方法 121 模型制作 参照文献〔2〕方法：实验第1 天除正常空白对照组(对照组) 外,其余动物皮下注射CCl4 分析纯05 ml/100 g (体重),以后每隔3 d注射40% CCl4 橄榄油剂03 ml/100 g(体重),连续8 g/(kg·d)-1，共8 l，制备成100 g/L肝组织匀浆，4 000 r/min 4℃离心，取上清液保存于-20℃。肝右叶置于40 g/L中性甲醛液中常规固定后，石蜡包埋，用于制作组织芯片。 13 检测指标 131 血清及组织纤维化指标检测 测定血清肝功能包括总胆红素(TBIL)、丙氨酸氨基转移酶(ALT)、白蛋白(ALB)、A/G，检测透明质酸(HA)，Ⅲ型前胶原(PCⅢ)，N型胶原()，层黏蛋白(LN)含量(放射免疫分析法):肝匀浆检测羟脯氨酸(HYP)含量(二甲氨基苯甲醛法)，检测试剂盒购自南京建成生物工程研究所，均按试剂盒说明书操作。 132 病理检测 组织芯片分别行常规HE染色，Masson三色染色(染胶原纤维)及网织纤维染色，光镜下观察，并根据王泰龄等改进的肝纤维化半定量评分系统(SSS)〔3〕进行炎症活动度及肝纤维化程度计分。 133 免疫组织化学检查αSMA、TGFβ1 采用石蜡包埋常规切片,SP法,兔抗鼠TGFβ1,多克隆抗体及鼠抗鼠αSMA单克隆抗体均以1∶100 稀释,DAB 显色,苏木素复染。PBS 代替一抗作为阴性对照。阳性组织呈棕色，阴性组织呈蓝色在全自动图像分析系统上，采用HPIAS2000型图像分析软件进行定量分析，随机选取每张切片10个视野(×400)倍测定阳性细胞的A值与所占视野面积，取其乘积平均值为该组织切片所得值，两项乘积越大表明组织中该抗原含量越高。 134 RTPCR检测 大鼠GAPDH 上游引物:5′CATGACCACAGTCCATGCCATC3′,下游引物：5′CACCCTGTTGCTGTAGCCATATTC3′全长450 bp；TGFβ1 上游引物：5′TGAGTGGCTGTCTTTTGACG3′，下游引物：5′ACTTCCAACCCAGGTCCTTC3′全长350 bp。αSMA上游引物：5′AAGAGGAAGACAGCACAGCTC3′,下游引物：5′GATGGATGGGAAAACAGCC3′称取50～100 mg 肝组织用Trizol 提取总RNA，采用分光光度法测定其含量及纯度，测定A260/A280 值。取2 μg 总RNA，42 ℃逆转录90 min。参数设置94 ℃变性,3 min ×1 循环。94 ℃变性30 s，53 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，共35 个循环。最后72 ℃彻底延伸7 min ×1 循环。同法扩增GAPDH 作为内参照。取5 μl PCR 产物15%琼脂糖凝胶电泳。凝胶图像分析系统检测灰度,TGFβ1/GAPDH 比值表示TGFβ1 mRNA 相对水平。αSMA/GAPDH 比值表示αSMAmR2NA 相对水平。 14 统计学分析 实验结果计量数据以x±s表示，经SPSS1110软件包进行方差分析，组间比较采用t检验。 2 结果 21 各组大鼠