核酸扩增技术(NAT)在血液HBV DNA筛查中的应用研究论文.docVIP

　　核酸扩增技术(NAT)在血液HBV DNA筛查中的应用研究论文 【关键词】核酸扩增技术(NAT)血液HBVDNA筛查 输血相关传染病的预防和控制已成为全社会关注的焦点，随着检测技术的不断进步，输血传播相关病毒的危险性大大降低，目前酶免疫检测(ELTSA)技术已经广泛应用于血液筛查，但每年仍有少量新发输血后肝火病例报道，如美国无偿献血者每单位供血传播HBV的危险性为1／6.3万。这些危险主要来自病毒感染者“窗口期”献血、病毒变异、低病毒载量感染及人工操作失误等，其中“窗口期”漏检是影响血液安全性的主要问题。核酸扩增技术(NAT)可直接检测病毒核酸，大大缩短病毒ELISA检测的窗口期及检出变异株.freell)，HBsAgELISA国产试剂(上海科华)和进口试剂(美国Abbott)，乙肝两对半试剂(厦门新创)。 1.2检测对象 2008年8月～2009年12月无偿献血者标本共9239份。NAT筛查的标本用真空EDTA抗凝留取血样5ml，于8h内分离血清。 1.3血液的ELISA常规检测 所有标本均经乙肝金标试纸条和ALT试纸条筛查合格后，再进行HBsAg、抗-HCV、抗-HIV国产和进口试剂两遍ELISA筛查及梅毒、ALT检测。 1.4标本的汇集 将采集的5mlEDTA抗凝的全血室温离心3min(3600g)，保存2～4℃冰箱中，待血液标本ELISA常规筛查合格后，应用STAR2000，启动全自动汇集程序，按试剂盒要求进行8人份标本汇集，将每个汇集池的标本知码文件储存并输出以备追溯和确认使用。若汇集样经检检测为阳性，进行单个标本检测，以最终确认阳性标本。 1.5标本的浓缩 往每个汇集池中加入浓缩液40μl和促沉剂50μl，充分混匀后在Eppendort离心机以4℃离心1小时(25000～26000g)，留底部110μl左右样震荡混匀备用。 1.6核酸的提取 采用核酸提取试剂盒，在标本处理区按试剂盒要求准备六块板①～⑥，板①加去抑制剂20μl、浓缩样100μl、裂解液100μl及专用耗材-96Tipb，板②加磁珠溶液100μl，板③～⑤分别加洗涤液A、B、C200μl，板⑥加洗况液80μl，然后在KHB-DP1000磁珠分离仪上按程序说明逐步完成核酸提取。 1.7核酸扩增及检测 用全自动核酸扩增仪检测，按检测试剂盒要求准备PCR反应液(HBVPCR反应液A：HBVPCR反应液B：HBVPCR反诮液C：内标=8：6：1：0.2)，往反应管中加15μlPCR反应液及15μl已提取的核酸,.freell，可信限范围为55.8，548。 2.2已知HBVDNA阳性标本检测结果对7份 已知HBVDNA阳性的保存标本(经Roche试剂检测阳性)分别取样1200μl离心浓缩后进行核酸提取扩增检测和100μl直接进行核酸提取扩增检测，结果分别检也HBVDNA阳性6例和5例，检出率分别为85.7％、72.4％。采用随机双盲法混合了7份阳性血清(经单人份检测阴性)，进行混样检没，7例混样中共检出HBVDNA阳性2例，检出为28.6％，见表2。 阳性、定量测定无结果 2.3检测系统的精密性 对68次扩增实验的质控的CT值进行统计分析：计算前20个质控点：均值x-=30.081，SD=1.051，CV=3.49％。除了一次实验失控，CT值．CT值过高可能是质控样提取的核酸不足，导致扩增循环次数增加所致，其他实验质控艾在x-±2S范围内，见图1。 2.4质量控制 为监控实验进行，对整个实验进行有效控制，在每次检测过程依靠阴性、阳性对照、质控及内标进行监控。阳性质控品用来监测试剂以及实验室环境是否存在污染等可引起假阳性的系统误差及系统错误，以减少假阳性。阳性质控品用来监测试剂及整个实验过程产生假阴性的系统误差及系统性错误，以减少假阴性。内标是相当于加入每管中的阳性质控，监测每个反应体系产生假阳性的偶然误差及个体性错误，以减少标本的假阴性。阴性对照采用科华公司提供的阴性稀释血浆，质控品由科华公司提供(5×104拷贝／ml)，以阴性血浆稀释成150拷贝／ml，随样本一起检测，内标能被扩增出来，阳性对照、质控均能定性检出阳性。 2.5NAT检测结果 共对血清学筛查合格血液9239人份计1157个汇集标本进行扩增检测，初检发现HBVDNA阳性汇集标本6个，对所有初检阳性的汇集标本进行复检，结果全部阴性，假阳性率为0.52％，本次实验未检出HBVDNA阳性标本。从检测阴性谍集标本中随机进行单份检测(1400μl上样浓缩)，共检测234份，亦未检出HBVDNA阳性标本，见表3。 *1157个汇集池中有6个汇集池不是按8×150μl方案汇集，其中3个汇集池是4×150μl，另外3个分别是6×150μl、3×150μl、2×1