桥本甲状腺炎中Bcl┐2和Bax与PCNA关系的免疫组化双标法论文.docVIP

　　桥本甲状腺炎中Bcl┐2和Bax与PCNA关系的免疫组化双标法论文 .freeloto’s thyroiditis（HT）.METHODS Specimen from nontoxic goiter（NTG，n=16）16HT pa-tients munohistochemical double labelled staining repectively.RESULTS Apoptotic rates（AR）in the HT and NTG groups munostaining for Bcl-2and Bax on part of thyro-cytes from HT phoid cells ight regulate the imbalance betay be the major mechanisms of pathologic changes in the HT group. 0 引言 桥本甲状腺炎（HT）以甲状腺滤泡破坏，大量淋巴细胞浸润为主要病理改变.近年来，多数认为细胞凋亡在其发病机制中起重要作用.我们前期实验［1］ 显示:HT甲状腺标本中甲状腺上皮细胞Fas/FasL阳性细胞部分呈代谢旺盛状态.但HT时甲状腺细胞增殖特征如何，凋亡与增殖有无关联，值得研究.增殖细胞核抗原（PA）是一种和细胞增殖有关的核蛋白，为观察细胞增殖的良好指标［2］ .Bcl-2，Bax属于Bcl-2家族的分别抑制和促进凋亡的功能相反的蛋白质.我们以PA，Bcl-2和Bax为指标，采用免疫组织化学双标记及TUNEL法探讨HT时甲状腺细胞的细胞凋亡与增殖有无关联. 1 对象和方法 1.1 对象 1989/1999在西京医院普外科活检及手术的甲状腺标本，经病理诊断HT16（男1，女15）例，年龄26～59（平均42）岁;毒性甲状腺肿（NTG）16（男1，女15）例，年龄26～58（平均43）岁.入选患者均未经药物治疗.标本经40g L-1 多聚甲醛固定，石蜡包埋，制成3μm连续切片. 1.2 方法 原位细胞凋亡检测试剂盒（碱性磷酸酶）购自德国宝灵曼公司.TUNEL法:切片脱蜡至水→PK处理，37℃20min→PBS，2min×3→加TUNEL反应混合液，37℃2h→PBS，5min×3→加convert-AP，37℃1h→PBS，5min×3→bufferⅠ，5min×1→bufferⅢ，5min×1→BCIP/NBT显色，核固红衬染→封片观察.TUNEL阳性率代表凋亡率（AR）.免疫组化双标记:采用微波抗原修复免疫组化双标记En VisionTM二步法（Dako公司），按说明操作.第一标记PA（PC-10）为鼠抗人mAb（福州迈新生物技术有限公司），第二标记Bcl-2和Bax（为兔抗人多克隆抗体）以及标记液（SABC-AP）均购自武汉博士德生物工程有限公司.第二抗体鼠抗兔IgG及羊抗兔IgG均购自Sigma公司.以正常鼠及兔血清代替相应一抗作阴性对照.选取我们前期实验的HT标本（包括甲状腺上皮细胞及淋巴滤泡）及结肠癌作阳性对照.第一标记DAB显色，第二标记用SABC-AP标记，NBT/BCIP显色，未衬染. 1.3 实验处理 由2个独立观察者用10倍物镜对每个标本随机选取10个视野，求得凋亡和增殖阳性核占每一视野中总甲状腺滤泡细胞数的百分率.Bcl-2和Bax免疫组化结果判定:免疫染色阴性的标本为“-”;免疫染色阳性细胞较少，且散在分布者为“+”;免疫染色阳性细胞较多，分布密集者为“”.求出每组中“+”和“”标本所占总例数的百分比为该组标本阳性率. 统计学处理:采用SAS软件对HT和NTG两组的细胞凋亡率（AR）、增殖率（PR）及AR/PR进行t检验和χ2 分析;对Bcl-2，Bax免疫染色的标本阳性率进行Fisher精确概率检验. 2 结果 2.1 凋亡细胞的检测 TUNEL法染色阳性的物质位于胞核，呈紫蓝色颗粒.HT和NTG两组的AR分别为（34.0±14.7）%和（0.9±0.6）%（Tab1），有显著差异（P 0.01，Tab1）.NTG中凋亡细胞呈散 在分布.HT中凋亡细胞多位于淋巴细胞附近的甲状腺滤泡，呈簇状出现，凋亡的淋巴细胞少见. 表1 桥本甲状腺炎中细胞凋亡及增殖率 略 2.2 免疫组化双标记染色 HT和NTG两组的PR分别为（8.5±3.6）%和（4.2±2.4）%，HT组显著高于NTG组（P 0.01，Tab1）. 2.2.1 PA的表达及分布 PA免疫染色阳性物质呈棕黄色颗粒，位于胞核.在NTG中多位于小甲状腺滤泡，染色浅，阳性细胞呈立方状，少数扁平状.HT中PA阳性细胞分布广泛，免疫染色增强，在Bcl-2或Bax