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检测鼠粪中隐孢子虫卵囊方法的研究1 陈 甫, 黄克和* (南京农业大学动物医学院，南京，210095) 摘 要：目的 研究比较三种检测方法对鼠粪中微小隐孢子虫卵囊的检测效果，以便更好的 为临床诊断服务。方法 应用改良抗酸染色法(MAFS)、免疫荧光单克隆技术(IFA-McAb) 检测 法和PCR检测法分别对含有不同数量隐孢子虫卵囊的鼠粪样品、隐孢子虫病模型小鼠的鼠粪 样品和某牛场的牛粪样品进行检测。结果 MAFS检测法、IFA-McAb检测法和PCR检测法的检 测域值分别为10 g鼠粪中含有隐孢子虫卵囊2.0×104 4 2 、2.0×10 、2.0×10 个，3种方法操作 1次用的最短时间依次为35 min、60 min、3 h。三者对实验鼠粪样品的检出率分别为65.0 %、 70.0 %、85.0 %，牛粪样品的检出率分别为21.21 %、18.18 %、27.27 %，3种方法检出率之 间差异不显著(P0.05)。结论 MAFS检测法简单、快速，花费较少，条件要求不高，特异性 与IFA-McAb检测法相似，适合于对大量样品的检测和流行病学调查；IFA-McAb检测法、PCR 检测法必须应用精密仪器，更适合隐孢子虫的鉴定；PCR检测法特异性最强。 关键词：微小隐孢子虫卵囊；免疫抑制；抗酸染色法；免疫荧光；单克隆抗体；PCR 隐孢子虫病(Cryp tosporidiosis)是细胞内寄生原虫——隐孢子虫(Cryp tosporidium)引起的 一种人畜共患传染病，现在被认为是人和动物腹泻的主要原因之一。自从1907年捷克著名寄 生虫学家Tyzzer在小鼠粘膜组织中发现大量小鼠隐孢子虫(Cryptospor idium muris) 以来，关于 隐孢子虫感染的报道逐渐增多，1975年，Nime[1]报道了首例人的隐孢子虫感染，许多脊椎动 物、啮齿动物、禽类、两栖类、爬行类动物和鱼感染的报道也逐渐增多，尤其是上世纪80 年代初发现隐孢子虫与艾滋病有关后，日益受到各国学者的广泛重视。 近年来，隐孢子虫病已严重危害人类和动物的健康，并造成了严重的经济损失, 国内外 儿童发病率的上升和健康人群及动物携带者数量的增多对隐孢子虫病的检测提出了更高的 要求，因此，建立隐孢子虫病早期的实验室诊断技术具有重要意义。本文通过检测感染免疫 抑制BALB/C小鼠模型和奶牛场采集的粪便样品中的微小隐孢子虫卵囊，研究了抗酸染色 法、免疫荧光单克隆抗体技术与PCR检测法的检测效果，以便更好的为临床诊断服务。 材料与方法 1 试剂 pH 7.4 0.01 mol/L PBS(NaCl 8.0 g、KCl 0.2 g 、Na HPO ·12H O 2.85 g 、NaH PO ·2H O 2 4 2 2 4 2 0.2 g 、蒸馏水 1 000 ml，溶解) ；地塞米松磷酸钠注射液(武汉制药厂生产，批号 ； 单克隆抗体(本实验室研制保存) ；异硫氢酸荧光素标记的羊抗鼠抗体(华美生物制品公司生 产) ；磷酸甘油缓冲液(90 ml甘油加 10 ml 0.0 1 mol/L PBS 混合) ；TE配制：10 mmol/L Tris-HCl(pH 8.0) ：称取 0.120 g Tris加入 80 ml蒸馏水，用 1 mol/L 的HCl调至pH 8.0 ；2 % DTT 消化液：取TE溶液 10 ml ，加入 0.2 g DTT(二硫苏糖醇)配成 2 % 的溶液。 2 检测样品的准备 2.1 梯度样品的准备 6 5 4 3 2 将本实验室分离纯化的卵囊稀释成 2.0 ×10 、2.0 ×10 、2.0 ×1