丁二胺与戊二胺的介绍.ppt

* 尸胺是生物体内广泛存在的具有生物活性的含氮碱,它在腐烂的尸体中可以分离得到，但是由于含量较低,不适合大量生产 直接提取法 * 产量72g/L 2009年德国学者学者Martin·费尔科特,B·恩斯特等人以C.glutamicum 为出发菌株，经发酵、pH 调控、热处理、萃取、蒸馏纯化等过程，经80 h 发酵后，最终获得戊二胺产量可达72 g /L。 2005年日本东丽尖端融合研究所通过对赖氨酸工业生产上所用的谷氨酸棒杆菌进行转基因操作,把来源于大肠杆菌的赖氨酸脱梭酶基因的表达单元插入高丝氨酸脱氢酶基因座，发酵15小时生产出2.5g/L 产量2.5g/L 2010年天津科技大学牛涛等通过PCR 扩增获 得蜂房哈夫尼菌 中的赖氨酸脱羧酶基因ldc，以 大肠/谷氨酸棒杆菌 穿梭质粒pXMJ19 为载体，将目的基因ldc 克隆至谷氨酸棒杆菌中，经36 h 发酵，产量为0. 96 g /L 产量0.96g/L 微生物直接发酵法 * 产率38% 日本学者Takahshi 研究大肠杆菌 的游离细胞，以D，L －赖氨酸为底物通过LDC不对称降解L －赖氨酸获得D－赖氨酸和1，5－戊二胺，经过多步骤的产物分离过程，可达到38%的产率。产物分离过程复杂,成本高，细胞无重复使用性。 蒋丽丽等研究了4种固定化蜂房哈夫尼菌菌体细胞的材料和方法,包括海藻酸钙包埋法，半透膜透析袋法,海藻酸钙一明胶交联包埋法和明胶包埋法，其中海藻酸钙包埋法稳定性最好。用该方法转化测得酶活可达1028.9U/mL，重复性佳:第一批固定化细胞酶活可达游离菌体的98.62%,第四批为第一批的38.68% 海藻酸钙包埋法 朱婧在《微生物转发L-赖氨酸为尸胺》的硕士论文中优化了产酶培养基和培养条件，经过20h的反应,细胞的酶活基本比较稳定,20h时还能保持起始酶活的91%,投入底物赖氨酸160g,应得尸胺111.1g,实际得到尸胺105.11g,尸胺收率为94.61%。 收率94.61 微生物转化法 * 采用游离细胞进行微生物转化法生产戊二胺，虽然能够富集赖氨酸脱羧酶，无重复使用性较差，并且由于菌种不能积累赖氨酸，需要外加赖氨酸作为酶的反应底物，故仍无法解决原料成本过高的问题。 * 2.4 戊二胺的代谢机理研究 L—赖氨酸脱羧反应机理 * L一赖氨酸脱羧酶(L一lysinedecarboxylase,简称LDC),是可逆的将赖氨酸脱C02生成尸胺(1,5一戊二胺)的酶，此酶是诱导性胞内酶,需磷酸毗哆醛为辅酶促进脱羧反应。LDC 存在于E.coli、尸杆菌( Bacterium cad averis) 、Hafnia alvei 等大多数微生物中，其也存在于高等植物中，如黄瓜等。其中细菌来源的赖氨酸脱羧酶有2 种: cad A 和 ldc C ，ldc C是功能基因，在任何时候表达量都很弱。此外，在携带ldc C 多拷贝量的菌株中，赖氨酸脱羧酶酶活会增加。 赖氨酸脱羧酶（LDC） * 1,5—戊二胺在E.coil中的代谢图谱 * 目前，在工程菌的研究改造方面多集中于C.glutamicum, C.glutamicum 的最佳生长pH 条件为中性，而ldc在中性条件下更有利于提高其表达量；因此，一方面有构建携带ldc基因或赖氨酸—戊二胺反向转运调节基因cadB的穿梭质粒，在C.glutamicum中复制表达蛋白;另一方面或将ldc基因插入到C.glutamicum的基因组中进行表达。 * 高浓度的尸胺不仅具有反馈抑制作用，还可导致细胞膜孔蛋白的关闭，影响细菌的正常生长，戊二胺代谢系统不仅包括其生物合成系统，还包括其转运系统、降解等代谢系统，我们需要深入研究微生物中1，5－戊二胺代谢途径、关键酶、代谢流动分配和控制因素等。 改造思路： ①主要通过过量表达赖氨酸脱羧酶基因，通过构建携有ldc基因的多拷贝质粒； ②用强启动子增强赖氨酸脱羧酶基因的转录水平；增加赖氨酸代谢支路的流量； ③增加1,5—戊二胺的排泄或筛选解除产物反馈抑制突变株以解除1,5—戊二胺对赖氨酸脱羧酶的反馈抑制； ④敲除压力反馈调节基因rpoS，降低戊二胺对菌体生长代谢的抑制作用。 * 技术手段： ①进行有效基因定向改造，利用易错PCR、DNA 改组、杂合酶、交错延伸等酶的体外定向进化的方法对赖氨酸脱羧酶进行基因改造； ②应用生物信息学和代谢组学等知识构建完善的代谢模型和计算模型，对产物代谢流进行分析； ③采取单因素、响应面法和正交设计法等方法，优化产酶培养基条件，从而达到提高酶活、进一步提高1，5－戊二胺产量的目的； ④采用恒温等离子诱变技术（ARTP）对现有高产赖氨酸工程菌进行等离子诱变，筛选正突变菌株。 * 2.5 简述德国巴斯夫公司有关戊二胺的提取工艺