双向凝胶电泳技术教案.ppt

双向凝胶电泳技术two-dimensional gel electrophoresis technology (2DE) 定义一：以凝胶为载体的双向电泳。 定义二：根据蛋白质的等电点和分子量大小，分别在凝胶介质二维空间上对蛋白质分子进行等电点聚焦和电泳来分离与纯化蛋白质的方法。 双向凝胶电泳的原理：该技术是在1975年由意大利生化学家O’Farrell 发明的。根据蛋白质等电点和分子量的差异，连续进行成垂直方向的两次电泳。第一向为等电聚焦（Isoelectric facusing，IEF)电泳，其基本原理是利用蛋白质分子的等电点不同进行蛋白质的分离。第二向为十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS),它是按蛋白质分子量的大小进行分离的,再用考马斯亮兰或P银染进行检测，经Pdquest等软件对结果进行对比，解析。 2D技术应用中的关键步骤： 1、样品制备（蛋白提取）： （1）细胞培养、处理和收集； （2）将细胞在IEF裂解缓冲液中溶解； （3）将样品离心以去除不容的细胞碎片和DNA，提取上 清，-80 ℃保存。 2、蛋白质定量和上样： （1）固相PH梯度干胶条（immobi-linePH Gradient,IPG）水化、等电聚焦； （2）IPG的平衡； （3）SDS； (4)蛋白质检测：考马斯亮兰染色或银染色； 3、图像分析及数据处理： 将染色后凝胶放在GS-710,光密度扫描仪上，扫描后的图像用PDQUEST 2DE软件分析，选择部分匹配的蛋白质斑点进行比较。 制备原则： 由于双向电泳所分析样品的多样性，没有一种通用的制备方法适用于各种样品。但有几条共同的原则需要遵循 （1）尽可能溶解全部蛋白质，打断蛋白质之间的非共价键结合， 使样品中的蛋白质以分离的多肽链形式存在 （2）避免蛋白质的修饰作用和蛋白质的降解作用 （3）避免脂类、核酸、盐等物质的干扰作用 （4）蛋白质样品与第一向电泳的相容性。 蛋白质样品处理： 在制备蛋白质样品的过程中，最好适用Dnase（脱氧核糖核酸酶）和RnaseA（核糖核酸酶）来降解核酸。如果样品中含有较多的核酸会增加样品的粘性并造成非斑点处的背景拖迹，甚至还可能封闭凝胶孔。在蛋白样品裂解时，应以溶解尽可能多的蛋白质和保持在整个双向电泳过程中蛋白质的溶解性为主要目标。目前增加蛋白质溶解性的方法主要是适用变性剂，如尿素、硫脲，可以打破蛋白质的高级结构，打断非共价连接。 双向电泳的应用 双向电泳的分辨率较高，自第一次应用该技术以来，其分辨率已从15个蛋白质点发展到10000多个蛋白质点。一般的双向电泳也能分辨1000-3000个蛋白质点。因此，双向电泳被广泛应用与农业，医学等研究领域。 由于蛋白质的等电点和分子量是两个彼此不相关的重要性质，而2DE 同时利用了蛋白质间的这两个性质上的差异分离蛋白质，因此2DE的分离能力非常强大，它甚至能将细胞中5000种蛋白分离开，2DE 在分离蛋白混合样品，比较差异方面有不可替代的作用，结合质谱鉴定技术可查明大型蛋白复合物各组组分，与其他生物技术如分子生物学，分子遗传工程，免疫学，微量蛋白质的自动氨基酸序列分析相结合，可以快速准确的 发现和鉴定新的蛋白质。 双向凝胶电泳技术当前面临的挑战是： (1)低拷贝蛋白的鉴定。人体的微量蛋白往往还是重要的调节蛋白。除增加双向凝胶电泳灵敏度的方法外，最有希望的还是把介质辅助的激光解吸/离子化质谱用到PVDF膜上，但当前的技术还不足以检出拷贝数低于1000的蛋白质。 (2)极酸或极碱蛋白的分离。 (3)极大（＞200kD）或极小（＜10kD＝蛋白的分离。 (4)难溶蛋白的检测，这类蛋白中包括一些重要的膜蛋白 (5)得到高质量的双向凝胶电泳需要精湛的技术，因此迫切需要自动二维电泳仪的出现。 细胞处理： 对于组织细胞，首先需将其破碎，尽可能地将蛋白质组分溶解在缓冲液中，以便在适当的电泳条件下分离。 组织细胞破碎的方法包括低渗、匀浆、超声、反复冻融等。而对于体液成分，如血清、腹水、尿液等，仅需经过稀释、加热变性、溶解于适当缓冲液便可用于双向电泳。 等电聚焦 等电聚焦是20世纪60年代建立的蛋白质分离技术，基本原理是利用蛋白质或其它两性分子等电点的不同，在一个稳定的、连续的pH梯度中进行分离和分析。IEF具有分辨率高（0.01pH单位）、抵消扩散作用、可使浓度较低的样品达到高度浓缩等优点，不仅可以用来分离两性大分子，还可以通过测定等电点来鉴定蛋白质。根据建立pH梯度的原理不同，可以分为载体两性电解质pH梯度（Carrier ampholytes p