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液相色谱条件的分析和建立主讲人 :李效宽日期 : 2010年11月地点：武汉 HPLC分离原理 样品组分在流动相和固定相之间进行分配，由于不同组分与固定相之间的交互作用能力(吸附.分配.离子交换.分子尺寸等)不同，使得不同组分在色谱柱上的移动速率不一样，从而产生色谱分离。(必要条件) 不同类型样品的方法选择 色谱柱的选择 根据分离方式分类 (1)正相色谱：SiO2； CN；NH2 (2)反相色谱：C18；C4；C8；CN；NH2 ；苯基 (3)离子交换色谱： 阳离子官能团：－SO3H磺酸基、－COOH羧基等 阴离子官能团：―R4N＋季铵基、-氨基等 (4)凝胶色谱：水溶性凝胶过滤（GFC）； 油溶性凝胶渗透（GPC） (5)其它类型：手性柱等 1.填料基质：硅胶、氧化铝、聚苯乙烯等 2. 键合相： C4、C8、C18、苯基、氨基、氰基等 3.孔径：60-100A 分子量2000 300A 分子量2000 4.粒径：2um-10um 5.内径：10mm以下（分析）， 10mm以上（制备） 6.长度：100、150、250、300mm 色谱柱填料选择 粒度均匀（3，3.5, 5 um), 粒径小，柱压高，理论塔板数高，容易堵柱。 低酸度表面(硅醇基团被屏蔽），可以减少拖尾 宽的pH 范围，可以有较大的调节自由度 色谱柱选择 长度：75mm,150mm,250mm,压力和理论塔板正比与柱长 内径：2mm,4.6mm,10mm 粒径：3um, 3.5um, 5um 孔径：100A,300A 流动相选择 溶? 剂 截止波长(nm)?水 190 乙腈 190 ?甲醇 210?乙醇 210?异丙醇 210 正己烷 210 ? 四氢呋喃 210 二氯甲烷 240 氯仿 240 甲醇和乙腈的紫外吸收图 分离度（R1.5）和峰型（1.05T0.95） 可接受的分离条件K 可以接受的分离应该是1k20,or 2k10 better。 K=(tr-t0)/t0 T0指 死时间，一般相当于溶剂峰出峰时间 K 与流速变化关系不大，K小受干扰大，k大则分析时间太长。 理论塔板数 分离度 w1 ,w2是峰1峰2的基线宽度 W0.5,1,w0.5,2是峰1和峰2 的半高峰宽 分离度与k（容量因子）的关系 所以分离的第一步就是控制1k20,或者最好是2k10 方法：有机相100%,90%,80%,70…… 每减少10%,k值变化为2.5~3倍 分离度80%-70%-60% 分离度（48%-47%-46%) 更换有机相 a :甲醇-水 b:THF-水 c:甲醇：THF:水 总结 1调节有机溶剂比例(10%)使k值可以接受 2 微调有机溶剂比例(1%)，使分离完全 3 更换有机溶剂MeOH,THF,CAN 4 混合使用有机溶剂 记录每一次条件变化对谱峰的影响 其他控制选择性的因素 流动相pH值 柱温 不同品牌色谱柱 离子对试剂 流动相pH值 1,2 酸性化合物 4,5碱性化合物 3中性化合物 图中曲线的拐点为该化合物的pKa pH5~7之间会有较好的分离，5附近比较稳定 流动相pH值 流动相pH值 pH值的影响(pka) 一组苯甲酸(pka=4.2)同系物的分离情况 A: pH 2.5 B: pH 3.0 C: pH 3.5 D: pH 4.0 pH值的影响 pH值必须在该缓冲盐的pKa±1以内才有较好作用，超过此范围，会使得色谱条件不稳定，重复性较差 由此得出磷酸盐缓冲液可用于pH 2.0-3.1,6.2.-8.2 醋酸盐缓冲液可用于pH 3.8-5.8 方式不同柱效不同 色谱条件 色谱柱：Kromasil C18 4.6×250mm 5um，柱温 ：室温，波长 ： 203nm 流速 ： 1.0ml/min 2.梯度：乙腈：水为流动相 1.流动相：乙腈：水（22：78）为流动相