蛋白质PEG修饰技术概述介绍.PDF

蛋白质 PEG修饰技术概述 聚乙二醇具有较广的分子量分布，随着平均分子量的不同，性 质也产生差异，当分子量小于1000Da时，聚乙二醇是无色无臭粘稠 的液体，高分子量的聚乙二醇则是蜡状白色固体，固体聚乙二醇的 熔点正比于分子量，逐渐接近 67℃的极限。毒性随分子量的增加而 减少，小于 400Da 的 PEG 在体内会经乙醇脱氢酶降解成有毒的代谢 物，而分子量大于 1000 Da 的 PEG 经过多年应用于食品业、化妆品 业和制药业证明没有毒性。 聚乙二醇分子中含有大量乙氧基，能够与水形成氢键，因而具 有良好的水溶性，同时又可溶于除乙醚、己烷、乙二醇以外的大部 分有机溶剂。大多数蛋白质经聚乙二醇修饰后，除保留或增加其水 溶性外，还可以获得在一些有机溶剂中的溶解性。在蛋白质溶液中， 聚乙二醇无论是处于游离还是结合形式，即使浓度很高，对蛋白质 分子都没有副作用。聚乙二醇修饰的蛋白质一般构象不会改变，其 结合物的生物学活性主要由结合物的蛋白质部分产生。 6 聚乙二醇具有免疫学惰性，即使分子量高达 5.9×10 Da，本身 的免疫原性也很低。临床上使用聚乙二醇修饰蛋白治疗未发现抗聚 乙二醇抗体产生。 在20种构成蛋白质的常见氨基酸中，只有具有极性的氨基酸残 基的侧链基团才能够进行化学修饰。常用的反应氨基酸包括赖氨酸、 半胱氨酸、组氨酸、精氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、丝氨酸、苏氨酸、 酪氨酸，N-端氨基和 C-端羧基。这些氨基酸残基上的反应性基团多 呈亲核性，其亲核活性通常按下列顺序依次递减：巯基氨基氨基 羧基(羧酸盐)羟基。根据化学修饰剂与蛋白质之间反应性质的不 同，修饰反应主要分为酰化反应、烷基化反应、氧化还原反应、芳 香环取代反应等类型，对蛋白质进行氨基、巯基和羧基等侧链基团 进行化学修饰。巯基通常存在于蛋白质的二硫键和活性位点上，而 羧基如果不与蛋白质上的氨基发生分子间或分子内中和反应，也很 难活化。因此，蛋白质或多肽分子最容易与修饰剂发生作用的位点 是分子表面赖氨酸残基上的氨基。 聚乙二醇修饰又称分子的 PEG 化（PEGylation），是 20 世纪 70 年代后期发展起来的修饰方法。将活化的聚乙二醇与蛋白质分子相 偶联，影响蛋白质的空间结构，最终导致蛋白质各种生物化学性质 的改变：化学稳定性增加，抵抗蛋白酶水解的能力提高，免疫原性 和毒性降低或消失，体内半衰期延长，血浆清除率降低等。 聚乙二醇修饰反应类型 在20种构成蛋白质的常见氨基酸中，只有具有极性的氨基酸残 基的侧链基团才能够进行化学修饰。常用的反应氨基酸包括赖氨酸、 半胱氨酸、组氨酸、精氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、丝氨酸、苏氨酸、 酪氨酸，N-端氨基和 C-端羧基。这些氨基酸残基上的反应性基团多 呈亲核性，其亲核活性通常按下列顺序依次递减：巯基alpha 氨基 E 氨基羧基(羧酸盐)羟基。根据化学修饰剂与蛋白质之间反应性 质的不同，修饰反应主要分为酰化反应、烷基化反应、氧化还原反 应、芳香环取代反应等类型，对蛋白质进行氨基、巯基和羧基等侧 链基团进行化学修饰。巯基通常存在于蛋白质的二硫键和活性位点 上，而羧基如果不与蛋白质上的氨基发生分子间或分子内中和反应， 也很难活化。因此，蛋白质或多肽分子最容易与修饰剂发生作用的 位点是分子表面赖氨酸残基上的氨基，包括alpha氨基或E氨基。 氨基修饰 蛋白质分子表面的游离氨基具有较高的亲核反应活性，一般不 处于活性中心部位，因而成为化学修饰中最常用的被修饰基团。主 要修饰氨基是赖氨酸的 e-、alpha-氨基和末端氨基。游离氨基在蛋 白质分子中含量较高，亲电性活化聚乙二醇和氨基酸的游离氨基反 应时，多为随机修饰，常有几个氨基被修饰，导致多态混合物的产 生，即使只结合一个聚乙二醇，也可能结合在不同的氨基位点上， 产生位点异构体。由于蛋白质只有一个末端氨基，因此对它的修饰 可以减少多态混合物和位点异构体的产生，但修饰末端氨基的聚乙 二醇反应时需使用硼氢氰化钠，有一定的毒性。氨基修饰最常用的 修饰剂为SS-PEG、SC-PEG、SPA-PEG、NHS-PEG2和ALD-PEG等。 巯基修饰 活化半胱氨酸的巯基往往处于蛋白质的活性中心部位，位于蛋 白质表面的自由巯基远少于氨基，因此修饰效率低下，修饰后蛋白 活性损失较大