体外转录与翻译.ppt

主讲人: 杜珍武 E-mail:phdzhw@ 基因体外转录与翻译 in vitro transcription/translation 基因体外转录与翻译 五、基因体外翻译的应用 2 预合成 高通量蛋白表达和纯化????? 在进行体内表达前往往先进行体外表达，因为体外表达可以表达一些毒性强、对水解敏感或者不稳定的蛋白。另外，体外表达另一个优势就是可以合成时插入带有光敏性、荧光或者生物素残基等标记，方便对蛋白进行定位。一个典型的体外表达系统产量大约是50μl，现在随着技术的改进许多公司的产品表达量也可以达到毫克级。 基因体外转录与翻译 五、基因体外翻译的应用 ??? 3 高通量筛选 筛选病毒特异翻译抑制复合物 筛选分子伴侣抑制药物 * 确定新型的孤受体（orphan receptor） 基因体外转录与翻译 五、基因体外翻译的应用 ??? 4 分子结构和定位分析 * 膜蛋白研究? 曾经有实验证明在体外表达系统中加入犬类的微粒体膜可以让跨膜蛋白G蛋白偶连受体正确折叠。 * 加入非天然氨基酸进行标记? 有实验表明经过修饰的带赖氨酸反密码子的tRNA可以将非天然的氨基酸插入到体外表达合成的多肽中。 * 蛋白折叠和分子伴侣相互作用研究 * 实时翻译/折叠实验 * 高分子组装 基因体外转录与翻译 五、基因体外翻译的应用 ??? 5 分子诊断 * 蛋白截短实验（Protein truncation test ，PTT） 这项实验发明1993年，可快速检测出基因突变。 基因体外转录与翻译 五、基因体外翻译的应用 ??? 6 功能基因组学 体外表达克隆 * 核糖体展示技术? Ribosomal Display，RD 基因体外转录与翻译 五、基因体外翻译的应用 ??? 7 功能研究 * 酶活分析? 有些蛋白通过体外表达方式仍然保持活性，因此可以应用这些样品进行酶活测定。如果在体外表达系统中不含有与待测定酶相同的酶活性，那么表达产物无需纯化就可以直接进行测定。另外，在体外表达系统中可以方便加入一些外部因子，从而可能省去一些要在细胞中进行的研究。 * 突变分析 * 翻译后修饰分析? 许多蛋白需要进行高级修饰后才能形式功能。目前，在兔网织红细胞系统中已经成功进行过磷酸化、腺苷酸化、豆蔻酰化、法呢醇化、异戊二烯化和蛋白水解活性修饰。额外的微粒体膜则可以对糖基化、甲基化和信号序列去除进行研究。 * 吉林大学 药学院 基因工程教研室 Genetic Engineering 基因体外转录与翻译 一、基因体外转录与翻译的意义 二、基因体外转录原理与操作 三、基因体外转录应用 四、基因体外翻译的原理与操作 五、基因体外翻译的应用 基因体外转录与翻译 一、基因体外转录与翻译的意义 基因体外转录与翻译 一、基因体外转录与翻译的意义 费事、费力、工序烦琐 ？？？ 体外操作 体内操作 研究蛋白质、RNA方便需要 快速、方便获得蛋白质、RNA 基因体外转录与翻译 二、基因体外转录原理与操作 1、基因体内转录的过程 需要的基本物质： DNA模板 启动子、结构基因 转录终止子 RNA聚合酶 四种核糖核酸 转录因子 基因体外转录与翻译 二、基因体外转录原理与操作 1、基因体内转录的过程 真核基因转录 原核基因转录 基因体外转录与翻译 二、基因体外转录原理与操作 2、基因体外转录的原理 基本的工作原理是以DNA为模板，在转录体系中的一系列转录因子的作用