(I)管柱装填.PPT

說明文字 說明文字 離子交換操作的關鍵在於膠體是否平衡好： 離子交換法是所有層析法中，最多樣、有效、方便的分離方法，但其機制也較為複雜且容易出錯，請把握以上各操作要點。 說明文字 說明文字 說明文字 說明文字 圖 3.4? 膠體過濾法的典型溶離圖譜： 介質粒子越細，色析法的解析力就越佳，但流動相的流速也就越慢。 介質粒子的大小，好像電視銀幕的解析度，粒子越小，解析力越好。粒子小可以降低粒子之間的空間，這些空間太大是降低解析力的原因之一 (見下圖)。 但因為粒子塞滿了所有空間，使得溶離液流過的速度變慢；流速太慢反而會導致解析力變差。 圖 3.3? 溶離液是以擴散方式進出膠體： 圖 3.3? 瀰散式膠體有較好的通透性： 上圖誇張管柱內粒子的大小，以說明對解析力或流速的影響。 粒子之間的空間，是造成解析力不好的原因之一；將粒子變小，可降低此空間，也因此可增加解析力。 若解析力差不多，儘快讓你要的蛋白質早點出來： 通常你都可以選擇多種膠體，但經常都是優劣互見。但若無特別考量，請選擇可讓你的蛋白質早一點流出來的膠體介質。當你要分別純化上圖紅色或青色兩個色帶時，你的選擇如何？實際去試試看，可能是最簡便的方法。 說明文字 圖 3.5? 液相層析管柱系統： 多練習膠柱的裝填，並注意所有預先設定的條件。 預先算準所需要的膠體，好好平衡在指定的緩衝液，並且把該膠體及管柱，事先保存在操作的溫度下；這樣的預備工作，幾乎已經成功一半了。 說明文字 說明文字 說明文字 說明文字 說明文字 實驗之前請仔細檢討並且把握住這些條件。 雖然理論的文字論述不能替代實際操作，但若能在操作之前後都有以上的考慮，則將會使成功機率大增。 其中，膠體『緊密裝填』可能是最重要的考慮因素。 說明文字 說明文字 說明文字 說明文字 說明文字 說明文字 離子交換介質表面的微環境會比緩衝液高或低一個 pH 單位： 例如上左圖的陰離子交換擔體，因為本身帶有正電，因此會吸引緩衝液中的 OH- 離子，造成擔體表面的局部高 pH。若有一樣本蛋白質的 pI 為 6，則使用 pH 為 7 的緩衝液，將使得此蛋白質帶有負電荷，可以吸附到上述陰離子交換介質。 而當此樣本蛋白質吸附到擔體時，微環境的 pH 事實上是 8 (比緩衝液多一個 pH)，因此會帶更多負電，更容易吸附到介質上。因此在這種情況下，所使用的緩衝液 pH 只要比樣本蛋白質的 pI 稍高或低 1 pH 單位即可，以免吸附太強而難以溶離下來。 圖 3.7? 離子取代順序： 說明文字 說明文字 說明文字 離子交換法多以鹽梯度進行溶離，有兩種梯度做法： 連續梯度需要梯度製造器 (左圖)，分別裝有高限及低限溶液，則可拉出由低到高的連續梯度。階段梯度則依序換各種濃度的緩衝液，成為樓梯般的段落，不須梯度製造器。不管用哪一種，管柱內膠面上方不可以有液體存在 (右圖)；這個多餘的體積，稱為 無效空間 (dead volume)，會破壞做好的梯度。 說明文字 說明文字 溶離體積越大，分離效果較好，但樣本濃度變稀： 同樣 0~0.5 M 的 NaCl 梯度，可以因為體積不同，而拉出不太一樣的結果。上圖的總體積只有 100 mL，看起來較為陡峭，但兩個溶離峰似乎沒有分得很好；下圖體積共有 300 mL，可以分得很開，但是但樣本變得很稀 (因為要分佈在 300 mL 範圍中)。因此，似乎中央的溶離方式比較折衷，兩峰之間分開了，而且不會太稀。 ■ 離子交換法操作要點 Summary on operation Equilibration Used gel should be regenerated and equilibrated well Elution Eluted with NaCl in continuous or step-wise gradient Elute through Flow target protein through and adsorb others Buffer pH Keep target proteins in weak charged state Non-specific Wash out contaminants with low NaCl concentration Gradient Use proper concentration and volume in elution Dead volume Eliminate any dead volume in the column Sample Equilibrate