分子克隆技术常用的的工具酶.ppt

分子克隆技术常用的工具酶;基因组DNA;目的基因;核 酸;Evaluation only. Created with Aspose.Slides for .NET 3.5 Client Profile 5.2.0.0. Copyright 2004-2011 Aspose Pty Ltd.;第一节 限制性核酸内切酶;Evaluation only. Created with Aspose.Slides for .NET 3.5 Client Profile 5.2.0.0. Copyright 2004-2011 Aspose Pty Ltd.;5’;5’;限制性核酸内切酶;AGCT;一、限制酶概念提出的背景 20世纪30年代，微生物学家发现，微生物的噬菌体不能交叉感染，如E coli K株的噬菌体只能感染E coli K株，不能感染其他株，反之亦然。这种现象称为“限制现象”。 1962年，W．Arber提出一个假设来解释上述现象。他认为这是细菌中有2种以上功能不同的酶，一种是核酸内切酶，能识别并切断外来DNA分子的某些部位，使外来DNA失去活性，限制外来噬菌体的繁殖，把这类酶称为限制性核酸内切酶.;E coli K株 噬菌体;限制性内切酶;NNNNNNNNNNNNGGATTCNNNNNNNNNNNNNNN;二、限制性核酸内切酶的分类;三、限制性核酸内切酶的命名原则 限制酶的命名是采用Smith和Athens提议的方案，即名称的第个1字母取自它来源细菌属名的第1个字母，大写；第2，3二个字母取自它来源细菌的种名的头2个字母，小写；如果它的来源菌还有株系，则有第4个字母；最后用大写罗马数字，代表同一菌株中不同限制酶的编号。前三个字母用斜体表示。 如Hind Ⅲ代表从流感噬血杆菌(Haemophilus influenzac) d株中分离到的第3个限制酶。 ;四、Ⅱ类限制性核酸内切酶 1 一般性状 分子质量为60 ku，单链多肽，最适pH为6～8； NaCl有抑制作用，能被Mg2+激活，巯基有保护作用， 对热不稳定，通常是溶于含有50％甘油的缓冲液中贮存于–20℃环境下。取出使用时必须立即置于冰浴中。 2 识别序列 它对底物要求有特异的序列，通常的识别序列是4 bp ～6bp，有些则为7bp～8bp，甚或多于8bp。 多数限制酶的识别序列为回纹结构，在识别序列内或其附近水解DNA链中的磷酸二酯键。;3 酶切切口 有些酶在识别序列内的对称轴上切割，其切割产物具平头末端； 很多限制酶不能精确地在2个对称轴部位切割，而在识别序列2条链对应位上错位切割，切割产物有些形成5’-突出的粘性末端, 另一些为3’-突出的粘性末端。这些粘性末端的任何一侧都能和另一末端互补配对，使任何含有该识别序列的DNA分子都能和另一个含相同识别序列的DNA分子容易地连接成新的重组分子。; ;5’NNNNNNNGAATTCNNNNNNNN3’ 3’NNNNNNNCTTAAGNNNNNNNN5’; 5’NNNNNNGTTAACNNNNN3‘ 3’NNNNNNCAATTGNNNNN5‘;4．贮存与应用 限制酶对热不稳定，贮存于-20oC，为避免反复冻溶使酶失活，商品酶均含有50％甘油，使用时添加相应的缓冲液稀释，降低反应液中甘油的浓度。;5 影响限制酶活性的因素;6 限制片段末端的连接作用;Evaluation only. Created with Aspose.Slides for .NET 3.5 Client Profile 5.2.0.0. Copyright 2004-2011 Aspose Pty Ltd.;; 能识别限制酶识别的序列，并把其中的某些碱基甲基化（常见使限制酶识别序列中的C或A甲基化修饰），属修饰酶类。 经修饰的DNA不再被限制酶降解。 已分离到与许多Ⅱ类限制酶相对应的甲基化酶。其命名是在对应II类限制酶名称前加一个M表示。 如M．EcoR I是能使EcoR I识别序列中(GAATTC)3’-端的A甲基化(GAm6ATTC)的酶; 识别序列中某些碱基甲基化对II类限制酶的影响至少有3种： ①敏感的，甲基化后不能再切割； ②不敏感的．甲基化后仍可切割； ③依赖于甲基化的，只有甲基化后才能切割。;第三节 与DNA合成相关酶类;一、大肠杆菌DNA聚合酶 I;聚合反应的特点：;5’;2）核酸外切酶活性;5’ A G C T T C A G G A T A ? 3’ | | |