第一讲 核酸化学实验技术-导学课件.pptVIP

《生化实验技术》 主讲：钱国英 教授 浙江万里学院 第一讲 核酸化学实验技术 第二讲 蛋白质化学实验技术 第三讲 酶学实验技术 第四讲 糖类化学实验技术 第五讲 脂类化学实验技术 第六讲 维生素和辅酶化学实验技术 案例1 目前，人们的生活中充斥了越来越多的转基因产品，如转基因大豆、转基因棉花、转基因玉米、马铃薯、水稻等等。 转基因作为一种新兴的生物技术手段，它的不成熟和不确定性，使得转基因食品的安全性成为人们关注的焦点。 什么是转基因食品？ 转基因食品：以转基因生物为直接食品或为原料加工生产的食品。 转基因食品利用现代分子生物技术，将某些生物的基因转移到其他物种中去，改造生物的遗传物质，使其在形状、营养品质、消费品质等方面向人们所需要的目标转变。 转基因食品的核酸检测技术 检测对象：转基因的启动子、终止子、抗性筛选基因、目的基因等外源基因 检测方法：普通定性PCR、实时荧光定量PCR、基因芯片 其中以普通定性PCR、实时荧光定量PCR最常用。 样品基因组DNA的提取 DNA提取质量检测 特有序列的PCR 琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物 进一步验证：测序、PCR产物酶切鉴定、实时荧光定量PCR方法等 案例2 某实验人员从土壤中分离筛选出一株产植酸酶的菌株，经形态学和生理生化特性初步鉴定为真菌。 真菌种类繁多，地球上大约存在150万种真菌，已经被发现和运用的大约有69000种。 设计特定引物对该真菌菌株中的基因组中的rDNA转录区的特定核苷酸片段进行PCR扩增，通过对所获得的PCR产物进行测序分析，与已知真菌序列比对即可确定该菌株在系统分类学上的位置。 实验设计要求： 根据案例提交一个具体解决基因组提取及分离鉴定的实验设计方案，包括从提供的不同材料中提取、分离得到基因组DNA，测定所得DNA的含量、纯度及分子大小，并利用已知引物进行PCR扩增，分析PCR检测的结果。 分组题目 项目1：定性PCR法检测转基因食品 项目2：rDNA-ITS扩增法鉴定真菌种类 实验目标 实验设计需包含的主要技术内容 基因组DNA提取：可选用浓盐法、阴离子去污剂法、苯酚抽提法、水抽提法、试剂盒法等 DNA含量测定：可选用二苯胺法、紫外分光光度法等 DNA纯度测定：紫外分光光度法 DNA分子大小测定：琼脂糖凝胶电泳 PCR技术 实验结果要求 实验时间安排 基因组DNA提取 4学时 DNA的含量与纯度测定 4学时 DNA的琼脂糖凝胶电泳 4学时 PCR及产物检测 4学时 课后研讨题 1.DNA提取的方法主要有哪些？并说明各方法的原理。 2.结合本人实验操作的体会，试述在提取过程中应如何避免大分子DNA的降解和断裂？ 3.查阅资料，说明提取的基因组DNA有哪些方面的用途？ 4.查阅资料，举例说明DNA琼脂糖凝胶电泳的应用和发展。 5.琼脂糖凝胶电泳所用DNA染料EB具有潜在的致癌性，查阅资料，查找可替代EB的染料并说明优缺点。 课后研讨题 6.结合本次实验，说明PCR技术的主要用途和发展。 7.通过本次实验，谈谈你对转基因食品安全性的认识。 8.查阅资料，说明转基因食品检测的常规方法。 9.查阅资料，综述常用的物种分子鉴定技术。 10.案例分析：在美国海豹突击队击毙本拉登几个小时后，美国总统奥巴马向全世界宣布拉登已被成功击毙，死者确定为本拉登的可能性是99.9%。查阅资料，根据所学核酸分子鉴定技术，分析如何对其进行法医鉴定。 相关事项 实验习惯 ——药品配制与保存 实验记录 实验交流 实验论文 研讨课要求 以大组为单位课后总结结果，讨论，制作一份ppt，课内讨论汇报。 ppt内容包括：实验背景和目的，实验主要原理，实验条件的选择，各小组实验结果和分析，课后研讨题，实验体会等。 保持基因组DNA结构相对完整：防止各种因素引起的降解。 纯度高：尽量排除其他大分子成分的污染（蛋白质、多糖和RNA等）。 得率好：选用合适的方法获得足够量的DNA。 三、基因组DNA提取的原理和方法 细胞破碎 细菌—溶菌酶（降解细胞壁），EDTA（抑制DNA酶，防止DNA降解），去垢剂SDS（破坏细胞膜） 酵母—破壁酶或液氮研磨 植物材料—液氮研磨（使细胞冻结，用研钵碾制成粉状） 动物组织—匀浆或液氮研磨 DNA与蛋白质的分离 SDS：真核生物的DNA与组蛋白结合形成DNP，SDS能够破坏DNA与蛋白质之间的静电引力或配位键，可使DNA与蛋白质解聚，释放出DNA。 CTAB：是一种阳离子去污剂，可溶解细胞膜，能与核酸形成复合物，在高盐溶液（NaCl0.7M）中是可溶的，当NaCl降低到0.3M 时，可沉淀CTAB-核酸复合物。 苯酚-氯仿-异戊醇：苯酚、氯仿能变性蛋白质，离心分