凝胶过滤层析法分离蛋白质试卷.ppt

实验一 凝胶过滤层析法分离蛋白质 1.掌握凝胶过滤层析法的基本原理； 2.掌握凝胶过滤层析法分离蛋白质的过程。 一、 实验目的 二、 实验原理 1. 常用生化实验技术 分光光度技术 电泳技术 离心技术 层析技术 2. 层析技术（色谱技术） 是利用混合物中各组分的理化性质差异（吸附 力、溶解度、分子形状和大小、分子极性、分子亲 和力等）建立起来的技术。 （1）层析系统的基本组成 固定相 + 流动相 固体物质 / 固定于固体物质的成分 可以流动的物质：如水和各种溶媒 待分离混合物（A、B）随流动相通过固定相 由于理化性质差异，与两相发生相互作用（吸附、 溶解、结合等）的能力不同，在两相中的分配（含 量对比）不同 与固定相相互作用力越弱的组分，随流动相移动时 受到的阻滞作用小，移动速度快 分步收集流出液，可得到样品中所含的各单一 组分，从而达到将各组分分离的目的 （2）层析法的分类 按两相所处状态分类 流动相 液体 气体 固定相 液体 液—液层析法 气—液层析法 固体 液— 固层析法 气— 固层析法 按层析原理分类 名称 原理 吸附层析法 固定相为固体吸附剂，利用各组分在吸附剂表面吸附能力不同而分离 分配层析法 各组分在流动相和固相中的分配系数不同 离子交换层析法 固定相是离子交换剂，各组分与离子交换剂亲和力不同而分离 亲和层析法 固定相只能与一种待分离组分专一结合，以此和无亲和力的其它组分分离 凝胶层析法 固定相是多孔凝胶，各组分的分子大小不同，因而在凝胶上受阻滞的程度不同 按操作形式不同分类 名称 操作形式 柱层析法 固定相装于层析柱内，使样品沿着一个方向前移而达分离的层析法，包括一般柱层析法、毛细管层析法和微粒填充柱层析法 平面层析法 层析过程在固定相构成的平面层内进行的层析法，包括纸层析法、薄层层析法和薄膜层析法 （3）层析技术的优点 分离效率高 分析速度快 具有极高的灵敏度 应用范围广 适用： 杂质多、含量少的复杂样品分析，尤其适用于生 物样品的分离分析 3. 凝胶过滤层析法（gel filtration chromatography） （1）原理： 根据分子大小的差别进行分离。每个凝胶颗 粒好象一个筛子，小分子物质可以进入颗粒内部， 大分子物质被排阻在外。 又名分子筛过滤，排阻层析 （2）凝胶的特点 属于惰性载体，不带电荷，吸附力弱，操作条 件较温和，可在相当广的温度范围内进行，不需要 有机溶剂，对于高分子物质有很好的分离效果。 交联葡聚糖凝胶 聚丙烯酰胺凝胶 琼脂糖凝胶 （3）凝胶的选择 葡聚糖凝胶 (商品名: Sephadex，Dextran) 型号: G-10 – G-200 多孔网孔结构 数字愈小,交联度越大,被筛分物质的分子量也愈小 吸水能力，每g干胶吸水量的10倍 Sephadex G-50： 对多肽及蛋白质的筛分范围(分子量)为: 1500 – 30000 Sephadex G-200： 对多肽及蛋白质的筛分范围(分子量)为: 5000 – 80000 例： B. 琼脂糖凝胶 ( 商品名: Sepharose , Bio- gel – A ) 对实验条件要求高 ( 温度, pH ) ＜40℃ 4.5- 9.0 工作的下限是葡聚糖凝胶工作的上限, 用于大分子物质的分离 C. 聚丙烯酰胺凝胶 商品名: Bio – gel – P（生物胶P） 三、实验操作 1. 柱的选择 直径： 1~5 cm 一般长度：直径 = 10：1 ~ 20：1 本实验玻柱： 直径0.8~ 1.5cm 长度 17~ 20cm 2. 凝胶选择、制备 血红蛋白 溶菌酶 分离 （64500） （11400） 选择 Sephadex G-50 Sephadex G-50： 对多肽及蛋白质的筛分范围(分子量)为: 1500 – 30000 制备： 将干胶颗粒悬浮于5 ~ 10倍的蒸馏水或洗脱液中 充分溶胀，溶胀之后将极细的小颗粒倾泻出去 3. 凝胶装柱 ①柱固定于架子上，垂直放置，关住出口 ②自顶部缓缓加入葡聚糖悬液，使G-50 开始下沉， 至1 ~2cm时，打开出口 ③凝胶逐层上升，至顶部 2-3cm时，