实验酵母醇脱氢酶的提纯及其性质的试卷.doc

实验 酵母醇脱氢酶的提纯及其性质的研究 醇脱氢酶（ADH）是生物体内重要的氧化还原催化剂之一，在生物催化、生物医学领域都有较为广泛的应用。生物体内的很多醇类代谢都是通过醇脱氢酶催化完成的。醇脱氢酶来源广泛，种类繁多，可按肽链长度分为短链、中链、长链醇脱氢酶，所含肽链氨基酸残基数分别为250、375和600~750，酵母醇脱氢酶（YADH）是其中研究和应用最为广泛的一种。酵母醇脱氢酶以NAD+/NADH为辅酶，可逆催化醇和醛/酮之间的氧化还原反应。酵母醇脱氢酶为四聚体，单个亚基肽链含347个氨基酸残基，亚基相对分子质量为35 000。 ）酵母醇脱氢酶的提纯 一、实验目的 1. 学习和掌握醇脱氢酶提纯的原理和方法； 2. 掌握醇脱氢酶活力的测定方法。 二、实验原理 以酵母为原料，利用热变性、有机溶剂沉淀蛋白质等方法，提取具有一定纯度的酵母醇脱氢酶。在提纯过程中，每经一步提纯处理，都需测定酶蛋白质含量和活力，并计算得比活力。有比活力提高了，才证明所用提纯措施有效，酶制剂的纯度提高了。 醇脱氢酶的辅酶NAD，它能催化乙醇脱氢变成乙醛，脱下的氢则使NAD+还原。CH3CH2OH+NAD+→CH3CHO+NADH+H+ 当有过量的醇存在时，NAD+ 被还原的速度与酶活力成正比，酶活力愈高，单位时间产生的NADH愈多。NADH对340nm紫外线有较强吸收，NAD+ 无此能力，因此可用测定A340nm的方法测得反应体系中NADH含量，从而得知酶活力的大小。本实验用Folin-酚试剂法测定蛋白质含量 三、实验材料、仪器和试剂 1．实验仪器： （1）干酵母粉：将鲜酵母分散成小块，放在搪瓷盘吹干。干燥后，研磨成粉末。 （2）烧杯 （3）吸管0.1ml、0.5ml、1ml、2ml、5ml（4）容量瓶 （5）试管 （6）量筒 （7）水浴锅 （8）台天平 （9）电子天平 （10）离心机（5000r/min） （11）722型分光光度计 （12）UV-900型紫外可见分光光度计 2．实验试剂： （1）3mol/L 乙醇溶液：量取无水乙醇（比重：0.789，相对分子质量：46.07）174.6ml，加蒸馏水稀释至1000ml（2）0.06mol/L 焦磷酸钠溶液（pH8.5）：称取焦磷酸钠（Na4P2O2·H2O）22.56g，溶于蒸馏水，稀释至1000ml。 （3）0.0015mol/L NAD溶液：称取NAD 0.0995g（NAD相对分子质量：663.44）溶于蒸馏水，稀释至1000ml。 （4）0.01mol/L 磷酸氢二钾溶液：溶1.74g K2HPO4于蒸馏水并稀释至1000ml丙酮（A.R.） 0.066mol/L 磷酸氢二钠溶液：溶9.37g Na2HPO4于蒸馏水并稀释至1000ml。 四、实验操作步骤 1．酵母醇脱氢酶的提纯 （1）粗提 置20g干酵母于250ml烧杯中，加0.066mol/L Na2HPO4溶液80ml，37℃水浴锅保温2h，不断搅拌、再于室温提取3h，离心20min（4000r/min）取上清液ml，测定蛋白质含量及酶活力，其余上清液量体积后，倾于150ml烧杯中。 热变性沉淀杂蛋白 将上清液55℃保温15~20min，不断慢速搅拌。保温毕，立即置冷水中冷却，离心20min（℃，4000r/min）。吸取上清液ml，测蛋白质含量及酶活力。其余上清液量体积后，倾于烧杯中。 有机溶剂沉淀杂蛋白 将上清液置盐冰浴中降温至-2℃以下，按100ml上清液加50ml丙酮的比例加入预先冷至-2℃以下的丙酮，边加边搅。加毕，放置片刻，低温离心（0℃，400r/min）。吸取上清液ml，测蛋白质含量及酶活力。其余上清液量得体积后，倾入已置于盐冰浴的烧杯中。 有机溶剂沉淀酶蛋白 按100ml上清液加55ml丙酮的比例，逐滴加入冰冷的丙酮，使溶液保持-2℃以下。待沉淀完全后，低温离心15min（0℃，4000r/min）。弃去上清液，沉淀溶于少量蒸馏水，转移至透析袋内，对冷水透析3h（在冰箱中进行）。离心除去沉淀，上清液即为达到一定纯度的醇脱氢酶制剂。 2.蛋白质浓度的测定吸取1、2、3步骤所取的样液及最后制得的酶制剂0.5ml，用蒸馏水稀释100~200倍。法3.酶活力测定 样液及酶制剂均需用0.01mol/L 2HPO4溶液稀释，稀释倍数如下： V（粗提取液）：V（2HPO4）=1：41：9V2（热变性去杂蛋白样液）：V（2HPO4）=1：91：9） V3（有机溶剂去杂蛋白样液）：V（2HPO4）=1：91：9） V（酶制剂）：V（2HPO4）=1：91：9） 吸取0.06mol/L 焦磷酸钠溶液0.5ml、3mol/L乙醇溶液0.1ml、0.0015mol/L NAD溶液0.1ml、蒸馏水2.2ml置于石英比色杯中（容量4m