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微生物限度检验标准操作规程
目的
规范微生物限度检验操作,确保检验结果准确、可靠。
依据
《中国药典》2010版。
范围
本标准适用于微生物限度检验。
责任
中心化验室负责人:对本规程的实施负责。
中心化验室检验人员:严格按照本规程执行检验操作。
程序
执行标准:《中国药典》2010版。
抽样:照《取样标准操作规程》进行。
6 细菌、霉菌及酵母菌计数
计数方法包括平皿法和薄膜过滤法。检查时,按已验证的计数方法进行供试品的细菌、霉菌及酵母菌菌数的测定。
6.1 设备、仪器及用具
6.1.1 设备
微生物限度检测室室、净化工作台、生化培养箱(30-350C)、生化培养箱(23-280C)、电热恒温水浴锅、烘箱、电冰箱、灭菌柜、紫外灯等。
6.1.2 仪器及器皿
显微镜、托盘天平、锥形瓶、研钵、培养皿、量筒、试管及塞、吸管、薄膜过滤器等。
6.1.3 用具
大、小橡皮乳头,洁净工作服、口罩、医用手套、接种环、酒精灯、酒精棉球、灭菌剪刀、灭菌镊子、不锈钢药匙、试管架、火柴、记号笔、薄膜过滤膜等。
6.2 试液
6.2.1 消毒液
A.0.1% 新洁尔灭溶液:供手消毒、擦拭操作台面用。
B.75%乙醇溶液
6.2.2 稀释液、试剂及配制
A.PH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液:取磷酸二氢钾3.56g、磷酸氢二钠7.23g、氯化钠4.3g、蛋白胨1.0g,加纯化水1000ml,微温溶解,滤清,分装,1210C灭菌15分钟。
B.聚山梨酯80
C.吐温80
D.单硬脂酸甘油酯
6.3 培养基
营养琼脂培养基、玫瑰红钠琼脂培养基
6.4 操作方法
6.4.1 试验前准备
6.4.1.1 将供试品及所有已灭菌的平皿、锥形瓶、试管、吸管(1ml、10ml)、量筒、稀释剂等移至传递窗内。每次试验所用物品必须事先计划,准备足够用量,避免操作中出入操作间。
6.4.1.2 开启微生物检测室紫外灯和空调净化系统,并使其工作不低于30min。
6.4.1.3 操作人员进入一更,用洗手液或肥皂洗手,烘干。进入二更,用0.1% 新洁尔灭溶液洗手,穿戴洁净无菌服、口罩、手套。
6.4.1.4 操作前先用乙醇棉球擦手,再用乙醇棉球擦拭供试品瓶、盒、袋等的开口处周围,待干后用灭菌的手术镊或剪将供试品启封。
6.4.2 供试液的制备
供试液的制备若需用水浴加温时,温度不宜超过450C,时间不得超过30分钟。除另有规定外,常用的供试液制备方法如下:
6.4.2.1 液体供试品
取供试品10ml,加pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100ml,混匀,作为1:10的供试液。油剂可加入适量的无菌聚山梨酯80使供试品分散均匀。水溶性液体制剂也可用混合的供试品原液作为供试液。
6.4.2.2 固体、半固体或粘稠性供试品
取供试品10g,加pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100ml,用适宜的方法,混匀,作为1:10的供试液。必要时加入适量的无菌聚山梨酯80,并置水浴中适当加温使供试品分散均匀。
6.4.2.3 乳膏剂
取供试品5g(或5ml),加至含溶化的(温度不超过45℃)的吐温80、3g单硬脂酸甘油酯、10g聚山梨酯80无菌混合物的烧杯中,用无菌玻璃棒搅拌成团后,慢慢加入45℃的PH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100ml,边加边搅拌,使供试品充分乳化,作为1:20供试液。
6.4.2.4 栓剂
取供试品10g,加适量稀释液,置45℃水浴保温10分钟,使溶,加入无菌聚山梨酯80 5-8ml,振摇使之乳化,再加稀释液(稀释液和聚山梨酯80的总量为100ml),摇匀,作为1:10的供试液。
6.4.2.5 肠溶制剂
取供试品10g,加PH6.8无菌磷酸盐缓冲液至100ml,45℃水浴中,振摇,使溶解,作为1:10的供试液。
6.4.3 供试液的稀释
取1支1ml灭菌吸管吸取1:10均匀供试液1ml,加入装有9mlPH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液的试管中混匀,即为1:100供试液。(此时操作一般为:左手执试管并将塞打开、倾斜,右手执10ml吸管吸量,注意:勿在乙醇灯焰峰正上方操作,以免灯焰将供试液中菌细胞杀灭)以此类推,根据供试品污染程度,可稀释至1:1000、1:10000等适宜稀释级。每递增1稀释剂,必须另换一支吸管。
稀释时,吸管插入第1级稀释液内不低于液面2.5cm,反复吸吹约10次。吸液时,应先吸至高于吸管上部刻度少许,然后提起吸管,贴于试管内壁调整液量至刻度,吸管移至第2级稀释管的内壁近液面处(勿接触液面)缓慢地放出全部供试液(吸管内应无黏附或残留液体)。
6.4.4 检查法
6.4.4.1 平皿法
6.4.4.1.1 在进行10倍递增稀释的同时,以该稀释级吸管,吸取每级稀释级供试液各1ml置每个灭菌平
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