江浙蝮蛇蛇毒激肽释放酶在麦胚无细胞蛋白合成系统中的表达和优化.pdfVIP

摘 要 本研究在成功克隆得到江浙蝮蛇蛇毒激肽释放酶目的基因的基础上，在蛇毒 激肽释放酶基因序列上引入 BamHI 和 Xho I 两个酶切位点以及由六个组氨酸组 成的组氨酸标签，并将其与pCS2+表达载体相连，构建了质粒pCS2+/ VK，经过酶 切测序验证插入方向正确且未引起碱基序列的变化。 将pCS2+/ VK 线性化后，进行体外转录，得到适合进行翻译的模板mRNA 。 再将mRNA 同自制麦胚抽提物以及翻译缓冲液混合，26 °C 孵育16 h，将反应后 的混合物进行SDS电泳，能够得到一条大约43kDa 的条带，经Western blot 验证为所需要目的蛋白。 麦胚无细胞蛋白表达系统在安全准确的合成功能蛋白方面具有很大的潜力， 但是能源物质的供应以及模板 mRNA 的稳定性一直是影响系统产率的主要因素。 本文中磷酸肌酸和丙酮酸作为提供ATP 二次能源物质加入系统中，在对蛋白产 率进行比较之后，发现磷酸肌酸更适合于麦胚无细胞蛋白合成系统；为了提高 mRNA 模板稳定性，向系统中补充了质粒载体、SP6 RNA 聚合酶以及铜离子， 并对这些条件进行了优化，最终建立了一个高效快速的麦胚无细胞蛋白合成系统。 当向系统中加入30 ng/μL 质粒载体、15 U SP6 RNA 聚合酶、25 mM 磷酸肌酸 以及5 mM Cu2+后，并在26 °C 反应16 h 时，蛇毒激肽释放酶产量从0.13 mg/mL 提高到 0.74 mg/mL 。 通过固定化金属亲和层析法 (IMAC) 对重组蛇毒激肽释放酶进行分离纯化， 将纯化后的蛋白透析冻干，将重组蛋白(1.3 U/mg)与天然蛇毒激肽释放酶(1.736 U/mg) 以及去糖基化后的天然蛇毒激肽释放酶(1.528 U/mg)的活性进行了对比，发 现重组蛇毒激肽释放酶比活力与天然蛇毒激肽释放酶比活力差异不显著，而与去 糖基化后的天然蛇毒激肽释放酶更接近。 本研究成果为进一步开展江浙蝮蛇蛇毒激肽释放酶结构功能研究以及麦胚 无细胞蛋白合成系统的工业化应用奠定了良好的基础。 关键词： 无细胞蛋白合成 麦胚 蛇毒激肽释放酶 重组蛋白 ABSTRACT The genome DNA of kallikrein from Agkistrodon halys pallas snake venom has been successful cloned. In this study, two restriction enzyme sites BamHI and Xho I and the His tag including six histidines have been added to the genome DNA of venom kallikrein. And the whole DNA was ligated into pCS2+, generating pCS2+/ VK. The insertion was indentified by restriction analysis and sequencing. After the linearization of pCS2+/ VK, the plasmid was transcribed in vitro and the mRNA of venom kallikrein was obtained. Then the mRNA of venom kallikrein was mixed with wheat germ extract and translation buffer and incubated at 26 °C for 16 h. After analyzed by SDSelectrophoresis and Western blot, the size of recombination venom kallikrein was about 43 kDa. Wheat germ cell-free protein synthesis system h