PCR、RT-PCR常见问题分析.ppt

PCR RT-PCR 六种Taq和MasterMix： Taq、Pfu、HotStart Taq、Taq plus、Long Taq、Taq Platinum dNTP 引物 SP6,Tn7,M13 Super RNase H- Reverse Transcriptase TA 克隆系统： pBS-T 载体、连接和克隆试剂盒 pGM-T 载体、连接和克隆试剂盒 pCF-T 、pCF-Blunt 载体、快速连接试剂盒 感受态细胞 DNA Marker：22种不同大小的分子量标准 TIANGEN相关产品 PCR引物设计 引物的重要性 引物设计是PCR成功的关键。 PCR引物设计大都通过计算机软件进行。可以直接提交模板序列到特定网页，得到设计好的引物，也可以在本地计算机上运行引物设计专业软件。 引物设计需要一定的经验，不能单纯依赖软件。 引物设计一般原则：长度 引物的长度一般为15-30 bp，常用的是18-24 bp，但长片段扩增时，引物长度30-35 bp。 引物过短易引起错配现象。 例：一个12bp的引物在人类基因组上存在200个潜在的退火位点，而20bp的引物在人基因组上存在的退火位点只有1/400个. 较长的引物（28-35bp)，还常用来区分同源性较高的模板序列或者用于产生一些突变位点。 引物设计一般原则：结构 尽量避免引物序列形成发夹，特别是3‘端。 尽量避免引物间形成二聚体、特别是3‘端前3个碱基间不能有二聚体。 避开局部富含GC或AT，3’端避开连续同样的碱基，如GGG，CCC和AT rich. 引物设计一般原则：错配 尽量避免引物在模板上有错配位点 3‘端尤其不要形成非特异性结合。 无法避免错配时，最好不要有产物生成。 引物3’端出现3 个以上的连续碱基，如GGG 或CCC，也会使错误引发机率增加。 引物设计一般原则: GC含量 引物序列的GC含量一般为40-60%，过高或过低都不利于引发反应。 上下游引物的GC含量不能相差太大。 不同的算法推荐45-55%或50-60% 引物设计软件 Primer Premier5.0 （自动有哪些信誉好的足球投注网站）* Oligo6 （引物评价） Vector NTI Suit DNAsis Omiga DNAstar Primer3 （在线服务） Primer premier5.0使用简介 主要功能: 1、引物设计 2、限制性内切酶位点分析 3、DNA基元(motif)查找 4、同源性分析 Primer premier5.0使用简介 引物设计最常用软件 引物序列自动有哪些信誉好的足球投注网站功能最强大 简单易用 可用于设计简并引物 Primer premier5.0使用简介 Primer Premier5.0下载、安装。 主页之下载中心 Primer Premier5.0使用演示 Primer premier5.0使用简介 Primer Premier5.0使用步聚： 粘贴序列: 复制序列FileNewDNA SequenceCtrl+V, 选AS is PrimerSerch设置引物参数OK 有哪些信誉好的足球投注网站完成再点OK，选择合要求的引物序列。 Blast检查引物特异性，必要时重新设计。 Primer premier5.0使用简介 Primer Premier5.0评价引物方法 粘贴序列: 复制序列FileNewDNA SequenceCtrl+V, 选AS is PrimerSEdit Primer Ctrl+VAnalyzePrimerOK PrimerAEdit Primer Ctrl+VAnalyzePrimerOK 免费引物设计服务 升博提供免费引物设计服务 免费引物设计服务注意事项 客户提供明确的序列 客户明确引物设计要求 设计报告以PDF文件提供，打开密码为升博网址。 确认合成请再发序列至升博邮箱: sbio1999@126.com Primer Premier使用实例 Human actin-beta Primer设计演示 致谢 Thank you for your attention! 谢谢你的关注！ S b i o. t m m u. c o m. c n 重庆升博生物科技有限公司 升博生物 专业服务 PCR常见问题分析及解决方案 重庆升博生物科技有限公司 SHENGBO BIOTECH CO., LTD. 反应体系对PCR扩增的影响 DNA模板 纯度 蛋白、多糖、酚类等抑制PCR反应 完整性 模板降解会导致PCR扩增无产物 浓度 浓度适当 引物 设计 长度适当、避免二级结构和二聚体 合成质量 浓度 50uL体系引物加量为10-20 pmol 反应体系对PCR扩增的影响 反