综合性实验流式细胞术检测细胞DNA含量.ppt

实验仪器及材料 实验仪器：流式细胞仪partec-cyflow 实验材料：Hela细胞 实验试剂：磷酸盐缓冲液、PI染液 实验步骤 制备单细胞悬液，细胞计数调整为1X106个/ml。 加入PBS，300-400g离心5min。 弃上清加入70%乙醇，4℃固定过夜。 离心，弃乙醇，加入PBS重悬。 筛网过滤，离心弃去PBS。 加入PI染液，4℃避光孵育20-30min。 上机检测。 实验报告 总结流式细胞术的基本原理。 总结利用流式细胞术检测经PI染色的细胞DNA含量的基本步骤。 绘制散点图和直方图表示检测结果。 综合性实验：流式细胞术检测细胞DNA含量 山东师范大学生命科学学院 邢维贤 实验原理 流式细胞术（flow cytometry）是利用流式细胞仪（flow cytometer）对悬浮细胞或微粒进行快速、多参数分析的现代细胞分析技术，能够同时定量检测单个细胞的多项指标。 流式细胞仪的发展起源于对细胞计数自动化的研究。 1934年，moldvan报道了对流动的细胞如红细胞、染色后的酵母菌的检测方法。 1947年，Gucker等首次采用了鞘液原理对气体中的微粒进行计数。 1953年，Crosland-Taylor成功设计了鞘液系统。 将待测的细胞悬液缓慢的注入一个快速流动的液流中，使该细胞液包绕在细胞悬液的外侧，形成鞘流（sheath flow），而细胞悬液始终处于轴流状态。根据牛顿流体在圆形管中流动规律的认识：鞘流速度越快，载物通过的能力越强，并且具有较强的流体动力聚集作用，据此，设计了流动室。 实验原理 1956年，coulter原理：在一个微孔两侧充满电解质溶液，通电时电流通过微孔，在压力系统控制下细胞或者颗粒流过微孔时，使微孔的截面积减小，由于细胞或颗粒的电阻与电解质相差较大，可以检测出微孔两侧电压变化脉冲，电脉冲的强度和个数则可以获得有关细胞大小和数目的信息。 现代流式细胞术对数据采集和分析的技术是从组织化学发源的，Kamentsky在组织化学的基础上提出了两个新的设想（1）细胞的组分是可以通过分光光度学来定量测量的；（2）细胞的不同组分可以同时进行多参数测量，从而可以对细胞进行分类。因此，对同一细胞可以同时获得有关不同组分的多方面信息，以此作为鉴别细胞的依据。 实验原理 Van Dilla和Los Alamos小组在1967年研制出液流束、照明光轴、检测细胞光轴三者相互正交，这是流式细胞计的基础。首次采用Feulgen反应对DNA 染色显示出DNA的活性与荧光之间存在着线性关系，并能够在DNA直方图上清楚的显示出细胞周期的各个时相。 1972年，LenHerzenberg等人在斯坦福大学研制出一台荧光激活细胞分选仪（fluorescence-activated cell sorter, FACS），它标志着流式细胞仪商品化时代的到来。 流式细胞仪的结构Structure of Flow Cytometer 流动室及液流驱动系统 流式细胞仪 激光光源激光束成形系统 光学系统 的结构组成 信号监测、存贮、显示、分析系统 细胞分选系统 流动室和液流驱动系统 Flow Chamber (Flow Cell) 将待测细胞制成单细胞悬液，用一定压力将待测样品压入流动室，不含细胞的磷酸缓冲液在高压下从鞘液管喷出，从而使鞘液能够包绕着样品高速流动，组成一个圆形的流束，待测细胞在鞘液的包被下单行排列，依次通过检测区域。 激光光源与光束成形系统Laser, light amplification by stimulated emission of radiation 流式细胞仪以激光作为发光源，经过聚焦后产生的光束，垂直照射在样品流上，被荧光染色的细胞在激光束的照射下，产生散射光和激发荧光。 前向角散射（FSC），与细胞直径正相关，常以此做阈值，排除碎片及其它颗粒，避免干扰。 侧向角散射（SSC），与激光束正交90度方向的散射信号，它对细胞膜、细胞质、细胞核膜的折射率更敏感，可以提供细胞内部结构和颗粒的信息。 仅仅根据FSC/SSC就可以区分外周血中的淋巴细胞、单核细胞、中性粒细胞。 光学系统 FCM的光学系统是由若干组透镜、滤光片、小孔组成。它们分别将不同波长的荧光信号送入到不同的电子探测器。在FCM的光学系统中最主要的光学元件是滤光片，主要有三类：长通滤片（LP）、短通滤片(SP)和带通滤片(BP)。 信号检测与分析系统Signal Scan and Analysis