热激诱导的玉米幼苗耐热性观及其生理生化机制研究.PPT

综合性、设计性实验内容—— 热激诱导的玉米幼苗耐热性观 及其生理生化机制研究 第一部分 实验背景 第二部分　植物材料的培养、热激和热处理 植物材料的培养 　品种为晴3或鲁玉13的玉米种子（购于西山种子公司）→ 用0.1% HgCl2消毒10 min后 → 用蒸馏水漂洗干净 → 用蒸馏水于26℃下吸涨12 h → 播于垫有6层湿润滤纸的带盖白磁盘（24cm×16cm）中 → 于26℃下暗萌发60 h →计算发芽率 → 选取长势一致的玉米幼苗做以下处理（去除较矮或较高的玉米幼苗）。 热激 　把上述玉米幼苗经42℃热激处理4 h并于26℃恢复培养4 h后。对照组（未热激）玉米幼苗仍在26℃下继续培养8 h。 热处理 　恢复后，然后把经热激和未热激的玉米幼苗转入47℃下高温处理14~17 h（白磁盘加盖）。 伤害率和存活率测定 　处理结束后，先观察伤害率（胚芽鞘明显变褐），在把玉米幼苗转到26℃下恢复培养7d，每天光照12 h，然后计算存活率（以恢复培养过程中能够转绿并恢复生长的玉米幼苗视为存活的幼苗）。 第三部分　　生理指标的测定 一、热激诱导的玉米幼苗耐热性部分生理指标的测定 伤害率 存活率 组织还原力（ＴＴＣ还原力） 膜伤害----丙二醛（ＭＤＡ）含量 １、伤害率的测定 ２、存活率的测定 ３、组织活力的测定 原理 　有活力的植物组织由于呼吸作用的存在，底物脱下来的Ｈ＋可以形成NADH2或NADPH2,无色的TTC（红四氮唑）可以被前者还原为红色的TTF（三苯基甲潜），其最大光吸收为485 nm。 测定：分别取48℃高温处理17 h 实验组和对照组的胚芽鞘0.２g →加入5 ml 0.6% TTC溶液（用50 mmol/L PBS,pH7.0配制）→抽气使TTC渗入组织→27℃,15 h →去除TTC溶液→着色的胚芽鞘加入少许石英砂和95%乙醇→充分研磨提取TTF→80℃水浴10 min → 冷却后定容到25 ml →测定OD485 →用OD485.g-1FW表示组织活力。返回 ４、MDA含量的测定 原理 　植物在遇到干旱、高温、低温、盐渍以及衰老等情况下，植物体内H2O2、O2.-、OH.等活性氧(reactive oxygen species, ROS)大量积累（返回），导致膜脂过氧化而积累MDA,因此MDA常作为植物逆境伤害指标。 在酸性条件下MDA与硫代巴比妥酸（TBA）反应生成粉红色化合物，此化合物在532 nm处有最高吸收峰，ε=155 mM-1.cm-1。 MDA提取：分别取0.5 g实验组和对照组的胚芽鞘→加入3 mL 5%三氯乙酸（TCA）和少许石英砂→充分研磨→用2 mL 5% TCA洗研钵→5000 rpm离心10 min →上清液定容至10 mL。 测定：分别取上清液各2 mL →加入0.6%TBA（用20% TCA配制） 2 mL→煮沸15 min→冷却后分别测定OD600和OD532。ASA测定。 计算： 二、热激诱导的玉米幼苗耐热性的可能机制 抗氧化酶系统，包括过氧化氢酶（CAT）、抗坏血酸过氧化物酶（APX）、过氧化物酶（POD）、多酚氧化酶（PPO）等。 抗坏血酸含量的测定 脯氨酸（Pro）含量的测定 蛋白质含量的测定 抗氧化系统测定实验背景 CAT、APX、POD、PPO是植物体中非常重要的末端氧化酶， CAT、APX、 POD可以清除植物体内多余H2O2，PPO可以把酚类物质转变为醌，后者对病原微生物起重要的抑制和杀伤作用。因此，它们在植物抗病性、抗热性等抗逆性中起着非常重要的作用，是植物抗逆性的重要生理指标。 抗氧化酶与植物抗逆性关系 抗氧化酶动力学曲线 １、四种抗氧化酶的提取 分别取0.5 g实验组和对照组的胚芽鞘→加入少许石英砂和3 ml提取液（50mmol/L PBS, pH7.0,内含0.１mmol/LEDTA, 0.2 mmol/L ASA,1%PVP） → 充分研磨　→转入离心管中→用2ml提取液洗研钵→ 10000 rpm离心10 min →上清液定容至5 ml →测定四种酶活性或分装后转至-20或-80℃保存。 　 2、CAT和APX活性的测定 原理 　H2O2和ASA分别在240和290 nm处有最高吸收峰，它们的毫摩尔吸收系数ε分别为0.0４和2.8 mM-1cm-1。因此，可以用单位时间内H2O2或ASA的消耗量分别表示CAT或APX活性。 CAT活性测定：反应混合液（ 50mmol/L PBS,pH7.0,内含１０mmol/L H2O2 ）2.9 ml→加入50 ml酶液→25℃预热５ min →加入600 mmol/L H2O2 50ml 启动反应→分别读出反应0.5 min和3.5 min的OD值→求出ΔOD240。 APX活性测定