獐子菌多糖的分离纯化及抗氧化活性的研究.DOC

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獐子菌多糖的分离纯化及抗氧化活性的研究

翘鳞肉齿菌多糖的分离纯化及抗氧化活性的研究 丁祥( (西华师范大学生命科学学院,西南野生动植物资源保护教育部重点实验室,四川南充,637009) 摘要:目的 分离纯化翘鳞肉齿菌多糖解析其结构特征,并研究其抗氧化活性。方法 采用热水浸提法,运用 DEAE-cellulose column 进行柱层析分离纯化2,2-联氮二 (3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸) 二铵盐H2O2作用下对PC12的保护能力从四川省小金县子实体分离纯化得到一种水溶性杂糖 () 纯品(SIKP-1) 抗氧化活性,结果显示当SIKP-1浓度为 0.1 mg/ml 时,mg/ml 时,在实验中,在用终浓度为0.,1,2 mg/mL的 SIKP-1处理下,PC12免于H2O2的损伤,随着剂量的增加其存活率越高,分别为15.89%,%,%。糖()具有显著的抗氧化功能,可以作为一种理想的天然抗氧化剂资源翘鳞肉齿菌多糖是由单糖组成的天然高分子化合物生物高分子家族中的最丰富多彩的成员。近代生物化学一直把多糖视做生物体中维持细胞组织结构 (如纤维素和几丁质 )和提供能量来源 (如淀粉和糖元 )的物质没有给予足够的重视加上多糖本身的复杂性目前研究水平要大大落后于蛋白质和核酸的研究。近二十年来由于分子生物学和细胞生物学的发展加上对膜的化学功能、免疫物质的化学研究及新药物资源的研究开发发现多糖及缀合物参与了细胞中的各种生命活动具有多种生物学功能引起人们极大的兴趣成为研究的热点翘鳞肉齿菌,又称獐子菌、仲帽、獐头菌。子实体中等至大型。菌盖初期突起,后扁平,中部脐状或下凹,有时呈浅漏斗状,浅粉灰色,表面有暗灰色到黑褐色大鳞片,鳞片厚覆瓦状,趋向中央特别大并翘起,呈同心环状排列,菌盖直径6-10cm运用柱层析分离纯化为真菌多糖的研究开发提供相关科学依据。材料1.1 菌株从四川省阿坝州小金县海拔 3600 m 的松树与栎树混交林里采集子实体(编号为 HT-1) ,其子实体样本均于 4条件下,保藏于西华师范大学生命科学学院西南野生动植物资源保护教育部重点实验室 1.1.2 试剂乙醇浓硫酸苯酚DEAE-cellulose column,氯化钠,氢氧化钠盐酸1,1-二苯基-2-苦基肼(DPPH-)NH4Ac,氯化铜30% H2O2,维生素C(Vc)2,2-联氮二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐(ABTS),氯化硝基四氮唑蓝NBT),PBS 磷酸缓冲液核黄素(VB2)蛋氨酸(Met)邻二氮菲(1,10-邻菲罗啉)新铜试剂(29-二甲基-110-菲啰啉) 方法 2.1 翘鳞肉齿菌多糖的提取 采自四川省小金县的新鲜00 g,洗净、烘干粉碎,90用蒸馏水提取 3 次,每次 6 h 离心收集上清液,减压浓缩4 ℃ 预冷后加入 4 倍体积无水乙醇醇沉,上清液减压浓缩,离心收集沉淀得粗糖[]。 1.2.2 翘鳞肉齿菌多糖的纯化自然沉降法装 DEAE cellulose52 色谱柱( 2 × 60 cm) ,脱气后用 dd H2O1000 ml)平衡层析柱,流速为/ min。称取上述除杂后的粗糖g,溶于 5 ml 蒸馏水中,上样于 DEAE cellulose52 色谱柱( 2 × 60 cm)分别以 0 mol / L、0.1 mol / L、0.2 mol / L、0.3 mol / L、0.4 mol / L、0 .5 mol / L NaCl 为流动洗脱相,流速为/ min,用自动部分收集器以每管 5 mL 收集洗脱,将收集到的样品溶液用苯酚硫酸法在 490 nm 波长下比色检测糖,以试管数为横坐标,以吸光度值为纵坐标,做 DEAE cellulose52 色谱柱层析洗脱曲图然后合并各个主峰溶液,低压冷冻干燥,得到糖()。 1.2.3 翘鳞肉齿菌多糖分子量测定 将 3 mg 翘鳞肉齿菌多糖样品溶解于 1 ml dd H2O 中,超声 5 min,进行高效凝胶渗透色谱HPGPC)分析,数据用 GPC 软件分析后与标准曲线对照测得分子量(标准品 T-10,20,50,80,130)。 1.2.4 翘鳞肉齿菌多糖红外谱分析 称量样品 2 mg 左右,KBr 压片,红外分光光度计4000cm-1- 400cm-1 []。 1.2.5 翘鳞肉齿菌多糖对 DPPH- 自由基清除能力的测定 自由基清除能力测定参照 Braca 方法[10],样品浓度mg / mL,取2 mL待测溶液,加入2.0 mL 0.2 mM 溶液用无水乙醇配制,摇匀后避光放 30 min 以乙醇来调零,在 517 nm 处测定 A 样品的吸光值同时测定 2.0 mL 样品溶液与 2.0 mL 乙醇混合液,在 517 nm 处的吸光度作为 A 对照,同一测定重复三次,以 Vc作为阳性对照清除能力=1-A 样品 / A 对

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