抗体的表达原理.ppt

* * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * 转基因动物表达系统表达抗体 在大肠杆菌、酵母或昆虫细胞中都很难获得与哺乳动物翻译后修饰、加工，特别是糖基化方式一致的重组抗体。在细胞培养条件下的蛋白表达与活体条件下的表达和调控也有很大区别。用于抗体规模化生产时，细胞培养的成本过高会制约其应用，小规模培养时这个问题更为突出。利用转基因动物作为生物反应器来生产重组抗体可以解决这一难题。目前转基因方法很多，在转基因小鼠上广泛应用的主要有两种方法： ①当基因整合位点不是主要因素时，将DNA直接注射到受精卵的精核中可以向小鼠基因组引入新基因； ②把DNA引入胚胎干细胞(ES细胞)的培养物中，这种办法通过基于同源重组的基因敲除来获得目的基因的稳定表达，这两种转基因的过程见图7-6。 (一)乳腺特异的调控序列 目前主要是在转基因动物的乳腺中表达外源蛋白，在乳腺中表达的抗体片段大多是与乳腺特异调控序列融合表达的嵌合蛋白，许多编码乳汁成分蛋白的调控区被用于重组蛋白在乳腺中的定位表达，如羊的β-乳球蛋白，牛的β-酪蛋白等。这些调控序列在应用时对抗体的表达量无太大影响，也没有明显的种属特异性，但相同的抗体片段融合于不同的调控区时，表达量有所差异。用于表达的抗体基因既可以是包括内含子的基因组DNA，也可以用cDNA。然而将外源抗体的cDNA序列连在这些调控区下游时却很难获得高效表达，选用较大的基出组片段(20kb)效果要好许多。 （二) 转基因动物的选择 小鼠、羊、牛和鸡等多种动物都可用于转基因的研究和生产。选择何种动物主要考虑产量和所表达抗体的性质。 植物表达系统 利用转基因植物作为生物反应器来生产重组蛋白始于20世纪80年代，伴随这项技术的日臻完善，出现了诸如“分子农业”以及“变植物为工厂)”等概念。在植物表达系统中生产的抗体称为植物抗体(plantibody)，它们可以是FV、ScFv、Fab乃至全长抗体，要获得临床前及I期临床实验用转基因植物约需2年左右时间。利用植物表达外源蛋白有许多优点，首先植物繁殖能力强，可以利用愈伤组织或原生质体连续培养．也可以从这些材料出发获得再生植株，这方面已经积累了很多的经验。其次，大多数植物的基因转化都是把外源DNA整合到基因组中去获得转基因植株，这样就可以利用有性杂交在材料间转移基因。 在植物转化中应用最多的方法是农杆菌介异的转化。利用不同的启动子可以实现 ScFv在细胞质、内质网、叶绿体及细胞间隙中的表达。农杆菌胭脂碱 合成酶基因（nos） 和花椰菜花叶病毒（ CaMV ) 的 35s启动子是常用的启动子．单子叶植物更多使用泛素的启动子。此外也可选择组织器官特异的启动子，抗性基因的选择以新霉素磷酸转移酶（nptII） ，潮霉素磷酸转移酶（hpt ）及氯霉素乙酰转移酶（cat ）为主。也可以使用葡萄糖甘酸酶（ GUS ） 及绿色荧光蛋白（GFP) 等报告基因作为筛选标记。 pBin19 是应用较广的Ti质粒载体．其基本结构如图 7-4 。 Ti质粒的特点 Ti质粒载体示意图 （一）全抗体及Fab片段的表达 到目前为止 IgG、IgM 、IgA等多种形式的抗体和各类小分子抗体片段都可在植物细胞中表达。最初是采用分别转化了重链和轻链基因的转基因植株进行杂交。从后代中筛选出能生成全抗体的个体。199 9年During 等将轻、重链基因克隆入同一个表达载体中后转化烟草。这样可以简化操作程序，缩短育种年限。全长抗体要完成正确的折叠和装配过程才能成为有功能的抗体分子。在哺乳动物细胞中新合成的蛋白质在前导肽的指导下进人内质网内腔，前导肽在内质网中切除。已知至少有两种胁迫蛋白Bip/GRP78 和GRP94作为分子伴侣与未经组装的轻、重链结合，指导其完成在内质网内的折叠与组装。在植物中完成组装过程时，轻，重链要同时带有前导肽。此前导肽可以来源于小鼠、植物或酵母。 目前仅有植物表达系统能大规模的商品化生产分泌型IgA(SIgA)这一独特的抗体。利用杂交瘤技术只能获得单体IgA，不能形成二聚体，采用化学偶联虽然可以得到SIgA，但不能大量生产。通过将SIgA的四种成分的基因分别转移到烟草中，经杂文选育获得了能生产SIgA的转基因烟草。 (二)ScFv的表达 在植物器官种子、块茎以及叶片中都可以表达ScFv等小分子抗体。因为