201606电镜制样选读.docx

电子显微镜技术电子显微镜样品制备技术:利用电子显微镜进行研究，必须首先把观察的对象制备成特殊的样品，这种方法就叫做样品制备技术。电子显微镜有它不同于光学显微镜的特殊性：它是利用高速电子流作电子光源，照射在样品上，通过电子和样品发生各种作用之后而使样品成像的。电子显微镜样品制备技术：透射电镜样品制备技术，扫描电镜样品制备技术第六章透射电子显微镜样品制备技术1.透射电镜样品制备技术：常规超薄切片技术，冷冻超薄切片技术，冷冻蚀刻（复型）技术，负染色技术，电镜细胞化学免疫电镜技术等2.在制备生物样品的时候需要考虑的三个问题。（1）．电子束的特点 电子束的穿透能力是有限的，在常规透射电子显微镜的工作电压（50~100KV）的情况下，所观察的样品厚度最多不能超过0.1μm（1000埃）。而一般的生物样品，象细胞的直径大约都在10μm以上；显然，电子束（除了在超高压电子显微镜之中）是穿透不过去的，那么也就无法研究它的内部结构。（2）．生物组织的特点 生物组织的主要成分之一是水，当生物样品放进电子显微镜的镜体的时候，镜体内的高真空必然使生物样品发生严重的脱水现象，这无疑地会改变组织内部的空间构型。也就是说，这时候的样品已经不能代表原来生物组织的结构。（3．）电子成像的机制 在透射电子显微镜中，电子像的反差主要是由于样品散射电子能力之间的差别造成的。但是构成生物样品的元素，如碳、氢、氧、氮、磷；这些元素之间散射电子的能力相差无几，所以说生物样品的固有反差总是很弱，观察起来会感到十分困难。3.超薄切片的厚度在10-100nm之间。它的制作过程与石蜡切片的制作过程很相似，也包括取材、固定（双固定）、脱水、渗透、包埋、聚合、切片和染色等几个环节。而与石蜡切片不同的是，超薄切片操作过程更为细致与复杂，要求更为严格，而且所用的试剂及配方也不尽相同。这成为电镜技术中最繁重、最艰难的工作，但又是最关键起决定作用的环节。常规超薄切片取材要求（1.材料新鲜 正常生活状态下的组织 （2．快。分离切取组织要迅速，尽快使组织与固定液作用，从而最大程度地保存组织在生活状态时的结构。 （3、小。组织块大小主要决定于组织的性质和制备样品过程中要用到的溶液（包括固定液、缓冲液、脱水剂和包埋剂等溶液）的扩散和渗透能力。一般样品块的大小不超过1立方毫米。（4、准。位置准确。 （5、取样时所用的器具必须干净，刀、剪等必须锋利，在 操作时尽量避免拉、锯、压等动作对组织细胞造成的机械损伤。5. 常规超薄切片取材要求（1）、 动物组织：大动物轻微麻醉，小动物绑牢并固定住，用锋利的刀、剪等暴露出取材部位，立即用吸管将配好的固定液滴到预定取材部位，然后用刀、剪、镊等准确而平稳地取下一块大小合适的组织块，置缓冲液中漂洗其表面之血液等 捞出切成小于1立方毫米的小块，用牙签尖端挑起组织块，放入盛有冷却的固定液的小瓶中固定。（2）、培养细胞、细菌等样品 ：取足量的混悬液，离心，去上清液。6.固定的作用(目的)：就是在组织块从有机体中取出之后，终止细胞的生化过程，同时把细胞的超微结构改变控制在最小范围内，避免细胞自溶和造成人为假像。7.目前，用于生物样品超薄切片技术的主要固定方法是化学固定法。8．在化学固定法中，有两个很重要的过程：一是形成稳定的蛋白胶体结构，这一结构的形成有赖于蛋白与蛋白之间稳定的交联作用，戊二醛、甲醛和四氧化锇都有很强的交联蛋白作用；另一个是稳定细胞以及细胞内部的膜结构，四氧化锇和醋酸铀都对膜结构的固定有重要作用，四氧化锇主要稳定不饱和脂类，而醋酸铀主要稳定磷脂。9.常用的固定方式：浸泡固定，灌注固定，培养细胞的固定。10.浸泡固定这种方法比较简便，它适用于一些能允许在短时间内停止供血仍保持其功能和结构的器官或组织，以及一些病理检查的样品。其方法是通过解剖（或手术）尽快从机体中取出所需的组织，并按取材的要求，把组织切成小块，进行常规的双重固定。浸泡固定主要的缺点是易使离体组织发生自溶，且因固定剂穿透慢而导致组织深处固定不好。一般的固定步骤包括：前固定（一般使用醛类固定剂）→缓冲液洗涤→后固定（一般使用四氧化锇）→缓冲液洗涤 。11.灌注固定一些取材比较复杂或对缺氧比较敏感的器官或组织等，采用解剖取材浸泡固定得不到理想的结果，必须采用血管灌注固定。所谓灌注固定就是将固定液通过血液循环的途径灌注到所需固定的组织中。灌注固定时，首先必须把动物麻醉。 全身灌注通常是直接用注射器（连接灌注液）通过左心室插入主动脉，并固定好针头。当注入固定液时，此时则用小剪刀在右心房刺一小洞作灌注液回流，待组织已达适当硬度时(一般需要10-15分钟)，取出所需组织，最后将组织块切成小块作常规浸泡双重固定。血管灌注固定与浸泡固定比较，灌注固定操作较为复杂，而且对固定液的消耗也很大。但它固定速度快，且固定