海岛棉茎尖的基因枪转化体系的建立.pdfVIP

 摘 要 棉花是世界上重要的经济作物之一。传统的棉花育种方法发展到今天，面临着种质 资源贫乏、远缘杂交困难等问题，利用基因工程技术改良棉花品种越来越受到广泛关注。 基因枪介导的遗传转化是近年来迅速发展的一种转化技术，它具有无宿主限制、靶材料 范围广泛、可控度高、快速等优点。然而，利用基因枪介导的棉花遗传转化仍然存在很 多问题，如海岛棉体细胞胚胎发生困难、基因型依赖性、转化效率低、转化周期长等。 因此，建立高效的基因枪介导的棉花遗传转化体系对棉花转基因育种具有重要意义。 本研究以新疆自育海岛棉品种新海13号茎尖和新陆早33 号胚性愈伤组织为受体材 料进行基因枪转化，研究基因枪转化的影响因素，建立高效的遗传转化技术体系；探索 海岛棉愈伤组织分化的有效途径，为新疆棉花育种奠定一定基础。取得的主要研究结果 如下： 1、以海岛棉新海13号茎尖分生组织为轰击受体，建立了基因枪法转化技术体系： 取暗培养4d ，光照培养1d的无菌苗茎尖作为靶材料，以直径为1.0μm、DNA包裹浓度为 1.5μg/μL的金粉为微载体，在渗透培养基MSBGS 中前渗12h后，选择真空度28inch Hg 、 轰击压力1100psi、轰击距离6cm进行基因枪的轰击；之后在渗透培养基MSBGS 中后渗处 理16h，恢复培养基MSBHF 中恢复24h ；移至卡那霉素抗性筛选浓度为120mg/L的筛选培 养基，筛选时间为35d左右。在添加4g/L活性炭粒的生根培养基MSBSG-1 中诱导抗性幼苗 生根，获得抗性再生植株。经过PCR和RT-PCR检测，共得到6株转基因再生植株，证明 抗除草剂基因EPSPS在转基因植株中得到表达。 2 、以陆地棉品种新陆早33 号的胚性愈组织为受体，进行基因枪遗传转化，前渗处 理4h ，后渗处理16h，轰击压力1100psi，轰击距离6cm，真空度28inch Hg ，恢复培养 24h 后，在卡那霉素浓度为60mg/L 的培养基进行筛选培养，诱导生根后获得抗性植株， 经过PCR 检测，获得7 个PCR 阳性再生苗，初步证明抗除草剂草甘膦基因EPSPS 已转 入新陆早33 号基因组中。 3、五个海岛棉品种在六种不同的愈伤诱导培养基（Y0-Y5 ）中均可以诱导出愈伤组 织，但不同的品种在相同的培养基中诱导，愈伤组织的生长状态有较大差异。新海 13 号无菌苗的胚根、下胚轴和子叶在愈伤诱导培养基Y5 （0.1mg/L KT ，0.1mg/L 2,4-D 和 0.1mg/L NAA ）中都可以诱导出疏松的愈伤组织，愈伤组织的生长速度下胚轴大于子叶， 子叶大于胚根。激素浓度和配比对新海 13 号愈伤组织的生长影响较大，诱导愈伤组织 分化的培养基Y1-1 （0.05mg/L KT 和0.1mg/L 2,4-D ）会使愈伤组织重新增殖出疏松的愈 伤，可能有利于愈伤组织的分化。 关键词：海岛棉；基因枪法；茎尖；胚性愈伤；遗传转化 Abstract Cotton is one of the important economic crops in the world. Traditional breeding methods on cotton faces many problems today, such as poverty on germplasm resources, difficulties in distant hybridization. It is concerned about making use of genetic engineering technology to upgrade varieties of cotton. The genetic transformation technique mediated by gene gun is developing rapidly in recent years. It has many advantages, such as no limited host and wider target materials, highly control degr